最近在做腺病毒基因克隆,吃了大亏,长了见识。
我总共要做6个克隆。先把6个基因的CDNA克隆到shuttle质粒pAdTrack-CMV,进展很顺利。然后用PmeI处理重组shuttle质粒,过夜酶切,也很顺利。但与腺病毒backbone质粒pAdEasy-1共转化时遇到了大麻烦。起初,我没有BJ5183Ecoli菌株,就想当然像拿DH5a替代,但一直不成功。无论CaCl2法和电转法都不行,挑出来的克隆不是只含重组shuttle质粒,就是同时含有两种质粒,即重组shuttle质粒和pAdEasy-1。但各是各的,二者并没有在细菌内发生同源重组。
于是我借了BJ5183Ecoli菌株,采用电转化法,这时总算有点成功。6个重组腺病毒质粒构建成功了4个。经酶切鉴定均这4个克隆均正确。但是,另外2个总是失败,原因不详。于是我就重复重复,期间,糟糕的事情发生了....电转杯总是被击破,Bio-Rad电转仪总是出现"检测到低压故障电弧”的字样。想来想去找不到好的对策。起初我以为是有气泡,于是在做电转时尽可能避免气泡的出现。遗憾的是,这毫无帮助,电转杯还是击一个破一个。我那个心疼呀。倒不是心疼杯子,心疼的是我的细菌、质粒,用Tip又吸不出来,所以只好把它们丢掉。
Finally,我发现了其中的问题。我改用去离子水来溶解重组shuttle质粒和pAdEasy-1时电转杯就再也不破了。我分析,原因可能与电转菌液的离子强度有关。当我放较大体积(>15ul)的质粒到BJ5183Ecoli菌(20ul)中时,里面的TE缓冲液可能导致电击时产生高强度电流,结果杯子就破了。由此看来,气泡本身对电击可能不无影响,反而会减弱电流强度。但离子强度就不同了,离子强度太高,足以导致一次实验报废。
后感:失败并不可怕,可怕的是想当然去重复,而不去探究失败的原因。朋友们,如在这方面好的经历坏的经历,尽可拿出来一起分享。
让我们一起成长。
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