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eEnzyme/cDNA Clone of H5N1 Neuraminidase (A/Vietnam/1203/2004)/NA-5023
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eEnzyme/cDNA Clone of H5N1 Neuraminidase (A/Vietnam/1203/2004)/NA-5023
品牌 / 
eENZYME LLC
货号 / 
NA-5023
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NA-5023

Name

pGH-H5 (AAW80723)

Description

Codon optimized full-length cDNA clone of Influenza H5N1 neuraminidase (aa1-439) (A/Vietnam/1203/2004)

Application

Optimized for mammalian cell expression

 eEnzyme是一家美国高质量生物学试剂及检测试剂盒品牌供应商,其与美国国立卫生研究院合作紧密,在全球范围内为广大科研客户提供高品质的产品与技术服务,其主要生产销售高质量的抗体和用于传染病研究的抗体/抗原细胞因子蛋白,pcr产品等用于分子和细胞生物学研究的生物试剂,产品应用于生物技术研究,制药,药物发现,癌症研究,传染性疾病,微生物和分子诊断等众多生命科学技术领域


eENZYME为科学界生产和销售高质量的生物试剂盒和生物分析试剂盒。与NIH密切合作以保证产品在生命科学研究的多个领域成功地使用。努力提供新颖价廉且有效的工具,使实验更容易成功。产品在科研、生物技术、制药和政府的研究实验室中得到广泛的应用,包括药物发现、癌症研究、传染病研究、微生物学和分子诊断。 


【简单介绍】eENZYME生产销售高质量的抗体和用于传染病研究的抗体/抗原,细胞因子蛋白,PCR产品等用于分子和细胞生物学研究的生物试剂,产品应用于生物技术研究,制药,药物发现,癌症研究,传染性疾病,微生物和分子诊断等众多生命科学技术领域。【详细说明】欢迎eENZYMEeENZYME生产销售高质量的抗体和用于传染病研究的抗体/抗原,细胞因子蛋白,PCR产品等用于分子和细胞生物学研究的生物试剂,产品应用于生物技术研究,制药,药物发现,癌症研究,传染性疾病,微生物和分子诊断等众多生命科学技术领域。 Ë ENZYMEis的高品质生物试剂及实验室设备科学界一个制造商和分销商。我们密切合作,与美国国立卫生研究院的社区,以保证我们的产品生命科学研究在广泛领域的成功表现。我们致力于提供创新和具有成本效益的工具,使您更容易取得成功。我们的产品用于在学术,生物技术,制药和政府研究实验室,包括药物发现,癌症研究,传染病研究,微生物学和分子诊断许多不同的应用。公司网站:www.eenzyme.com  目录号描述产品类型应用单位供应商IA-01SW-0100抗HA(A/California/06/09)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-011-0100抗H1(H1N1/Pan)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-001-0100抗HA1(A/新喀里多尼亚)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-023-0100抗-NP(A/新Caledonia/20/1999)(甲型H1N1流感兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-022-0100抗M2型(H1N1/A/新喀里多尼亚(H1N1))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004A-0100抗-H3(H3N2)(A/WIS/2005)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0100抗-M1(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004-0100抗HA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-020-0100抗-NA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005H-0100抗H5(A/香港Kong/483/97)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005-0100抗HA1(H5N1)(A/Vietnam/1203/2004)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-006-0100抗HA1(H5N1,禽流感)(A/斑头雁/Qinghai/12/05)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-010-0100抗-HA2(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-012-0100抗-M1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-021-0100抗-NA(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1,人)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-025-0100抗NS1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0100抗HA1(A/Chicken/NY/29878/91)(H2N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-009-0100抗HA1(A/chicken/HongKong/NT366/03)(H9N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-027-0100抗-NA(A/Chicken/HongKong/NT366/03)(H9N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-007-0100抗HA1(A/duck/Hainan/6/2004)(H6N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-008-0100抗HA1(A/鸡/荷兰/2/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-028-0100抗-NA(A/Chicken/Netherlands/1/03)(H7N7)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-0015-0100抗-H11(A/duck/Yangzhou/906/02)(H11N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0031抗B型流感(NP)的多克隆兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0032抗B型流感(医管局)多克隆兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-013-0100抗-H12(A/pintail/Alaska/102/05)(H12N5)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-014-0100抗-H4(A/environment/Maryland/1101/06)(H4N6)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-018抗-H15(A/Australia/83/00(H15N8))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-019抗-H16(A/Sweden/99(H16N3))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYME目录号描述产品类型应用单位供应商IA-01SW-0100抗HA(A/California/06/09)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-011-0100抗H1(H1N1/Pan)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-001-0100抗HA1(A/新喀里多尼亚)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-023-0100抗-NP(A/新Caledonia/20/1999)(甲型H1N1流感兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-022-0100抗M2型(H1N1/A/新喀里多尼亚(H1N1))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004A-0100抗-H3(H3N2)(A/WIS/2005)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0100抗-M1(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004-0100抗HA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-020-0100抗-NA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005H-0100抗H5(A/香港Kong/483/97)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005-0100抗HA1(H5N1)(A/Vietnam/1203/2004)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-006-0100抗HA1(H5N1,禽流感)(A/斑头雁/Qinghai/12/05)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-010-0100抗-HA2(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-012-0100抗-M1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-021-0100抗-NA(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1,人)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-025-0100抗NS1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0100抗HA1(A/Chicken/NY/29878/91)(H2N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-009-0100抗HA1(A/chicken/HongKong/NT366/03)(H9N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-027-0100抗-NA(A/Chicken/HongKong/NT366/03)(H9N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-007-0100抗HA1(A/duck/Hainan/6/2004)(H6N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-008-0100抗HA1(A/鸡/荷兰/2/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-028-0100抗-NA(A/Chicken/Netherlands/1/03)(H7N7)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-0015-0100抗-H11(A/duck/Yangzhou/906/02)(H11N2)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0031抗B型流感(NP)的多克隆兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0032抗B型流感(医管局)多克隆兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-013-0100抗-H12(A/pintail/Alaska/102/05)(H12N5)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-014-0100抗-H4(A/environment/Maryland/1101/06)(H4N6)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-018抗-H15(A/Australia/83/00(H15N8))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-019抗-H16(A/Sweden/99(H16N3))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYME目录号描述产品类型应用单位供应商IA-01SW-0100抗HA(A/California/06/09)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-011-0100抗H1(H1N1/Pan)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-001-0100抗HA1(A/新喀里多尼亚)(甲型H1N1流感)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-023-0100抗-NP(A/新Caledonia/20/1999)(甲型H1N1流感兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-022-0100抗M2型(H1N1/A/新喀里多尼亚(H1N1))兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004A-0100抗-H3(H3N2)(A/WIS/2005)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-003-0100抗-M1(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-004-0100抗HA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-020-0100抗-NA(H3N2)[A/Wyoming/3/03)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005H-0100抗H5(A/香港Kong/483/97)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-005-0100抗HA1(H5N1)(A/Vietnam/1203/2004)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-006-0100抗HA1(H5N1,禽流感)(A/斑头雁/Qinghai/12/05)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-010-0100抗-HA2(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-012-0100抗-M1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-021-0100抗-NA(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1,人)兔多克隆抗体WB等100微克eENZYMEIA-025-0100抗NS1(A/Vietnam/1203/2004)(H5N1)兔多克隆抗体WB等100微克eEN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当有大量的样本,多个微卫星标记需要分型时,需要本单元描述的分型方法。例如,用全基因缉的方法做一个疾病的连锁分析研究,需要在 500 个个体里检测 300 个标记,这样就要 150000 次基因分型。本单元描述的技术是用 Perkin-Elmer 的自动 DAN 测序系统,但也可以修改用于其他的自动荧光测序系统。 查看更多>
2021-07-30
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。 查看更多>
使用合成的寡核苷酸构建文库时,PCR 有两个重要的作用。第一,用与特定侧翼序列退火的引物来扩增文库,仅用少量的不同模板,就可以得到大量的 PCR 产物。第二,若要产生文库 DNA 的复杂互补链,PCR 合成法是有效的方法。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。 查看更多>
2021-07-20
PCR技术可用于:(1)检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态;(2)有效检测癌基因的突变,准确检测癌基因的表达量;(3)临床应用于检测地中海贫血的基因突变。 查看更多>
The following protocol is designed for subcloning inserts (I) from one vector into another vector (V). The inserts can be anywhere from 30 bp to 8 kb (possibly 查看更多>
2021-08-10
反转录 PCR ( reversetranscriptase'PCR,RT-PCR ) 是一种从 RNA 扩增 cDNA 拷贝的方法。RT-PCR 对于获得与克隆 mRNA 的5'、3' 末端序列和从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库方面都是极为灵敏与通用的方法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。 查看更多>
原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 查看更多>
对应于 mRNA 的 DNA 序列,可以被回收、克隆、测序,可以用作杂交或筛库的探针。 查看更多>
解放军总医院呼吸科(100853) 佘丹阳 刘又宁 克隆一株临床分离的多药耐药阴沟肠杆菌的ampC 基因,并研究其编码的AmpCβ-内酰胺酶的特性。聚合酶链反应(PCR)扩增阴沟肠杆菌ECLC074 的ampC 基因,将扩增的目标片段连接入pMD18-T进行双链测序后,进一步克隆入pACYC184 质粒,用获得的pACYC184/ampC 重组质粒转化大肠杆菌MC4100。采用琼脂稀释法测定阴沟肠杆菌ECLC074,大肠杆菌 MC4100 及大 查看更多>
对于高通量的筛选,推荐使用几个热循环仪厂家提供的 96 孔或 384 孔 PCR 板,或者使用单个的管子。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。 查看更多>
本方案描述了通过 PCR 扩增产物,来制作 cDNA 微阵列的实验步骤。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。 查看更多>
原核细胞l 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建1. PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段,片段5’端和3’端带有与IPTG诱导表达载体对应的限制酶位点。2. 含靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。3. 重组质粒转化有lacIq 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质 查看更多>
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[题目]JTopoisomeraseI-DNAcomplexescontributetoarsenictrioxide-inducedapoptosis.

[日期]BiolChem.2004Jun3


[作者]SordetO,LiaoZ,LiuH,AntonyS,StevensEV,KohlhagenG,FuH,PommierY.

[单位]NCI,NIH,Bethesda,MD20892.

[摘要]TopoisomeraseIisanessentialenzymethatrelaxesDNAsupercoilingbyformingcovalentDNAcleavagecomplexes,whicharenormallytransient.TopoisomeraseI-DNAcomplexescanbetrappedbyanticancerdrugs(camptothecins),aswellasbyendogenousandexogenousDNAlesions.Weshowherethatarsenictrioxide(apotentinducerofapoptosisthatinducestheintracellularaccumulationofreactiveoxygenspeciesandtargetsmitochondria)inducescellulartopoisomeraseIcleavagecomplexes.Bcl-2overexpressionandquenchingofreactiveoxygenspecies,whichpreventarsenictrioxide-inducedapoptosis,alsopreventtheformationoftopoisomeraseI-DNAcomplexes,whereasenhancementofreactiveoxygenspeciesaccumulationpromotesthesecomplexes.Thecaspaseinhibitor,z-VADpartiallypreventsarsenictrioxide-inducedtopoisomeraseI-DNAcomplexesandapoptosis,suggestingthatactivatedcaspasesfurthermaintainintracellularlevelsofreactiveoxygenspeciesthatinducetheformationoftopoisomeraseI-DNAcomplexes.DownregulationoftopoisomeraseIexpressiondecreasesarsenictrioxide-inducedapoptoticDNAfragmentation.Thus,weproposethatarsenictrioxideinducestopoisomeraseI-DNAcomplexesthatparticipateinchromatinfragmentationandprogrammedcelldeathduringapoptosis.

[翻译]拓扑异构酶I是一种很重要的酶,可以作用于DNA,与之形成短暂的DNA共价物,使DNA超螺旋结构解开。抗癌药物如喜树碱,以及内源性和外源性的DNA损伤剂可诱导拓扑异构酶I–DNA复合物形成。我们研究发现三氧化二砷(细胞凋亡诱导剂,能诱导细胞内活性氧和线粒体增多)可诱导拓扑异构酶I–DNA复合物的形成Bcl-2表达增加和活性氧的消失提示Bcl-2可以预防三氧化二砷引起的细胞凋亡以及防止拓扑异构酶I–DNA复合物形成,z-VAD不仅是caspases的抑制剂,也可以防止拓扑异构酶I–DNA复合物的形成,他的作用说明拓扑异构酶I–DNA复合物的形成很有可能是通过激活caspases导致细胞内活性氧的含量进一步升高。拓扑异构酶I表达下调会降低三氧化二砷诱导的细胞小体的生成,因此,我们推测三氧化二砷诱导的拓扑异构酶I–DNA复合物的形成很可能导致染色体的断裂和程序化细胞死亡。

[点评]一直以来,我们发现三氧化二砷可以用来治疗白血病,但对于它为什么能用来治疗白血病我们一直不太清楚它的机制,对于三氧化二砷的毒理研究目前是热点。希望通过本摘要的翻译,引起大家对毒物的机制研究的兴趣。
基克隆70代发展起项具革命性研究技术概括∶、切、连、转、选终目于通相应技术手段目基导入寄主细胞宿主细胞内目基量复制
"切"指用序列特异限制性内切酶切载体DNA或者切目基;"连"指用DNA连接酶目DNA同载体DNA连接起形重组DNA;"转"指通特殊重组DNA送入宿主细胞进行复制扩增;"选"则宿主群体挑选携带重组DNA体基工程技术两基本特点水平操作细胞水平表达水平操作即体外重组程实际利用工具酶DNA进行"外科手术"
基因克隆的流程 实验方法123
罪恶王冠4dN2017-11-07
选择目基,并设计相应引物;
用引物PCR扩增目基片段;
选择合适(抗性标记、酶切位点等)克隆载体(保真扩增),并PCR片段连接入克隆载体;(般用Taq酶PCR产物末尾自带A,Solution 1作用与两端各带T线性T载体直接相连)
连接产物转化入受态肠杆菌,使含抗素培养基扩增;
肠杆菌提取质粒(即前面连接产物),酶切鉴定测序鉴定均误目基片段切并与新表达载体连接,再转化入肠杆菌扩增,再提质粒,即想要目基片段克隆.
EST序列的基因克隆 123
颜魅家族Gj2021-08-15
利用计算机协助克隆基称电基克隆(sillcon cloning)与定位克隆、定位候选克隆策略并列即采用物信息延伸EST序列获基部乃至全cDNA序列EST数据库迅速扩张已经并继续导致识别与克隆新基策略发革命性变化
4.1
EST序列获取
利用计算机协助克隆第步必须获兴趣ESTdbEST数据库找EST途径寻找同源序列标准:度≥100bp同源性50%、85%通数万维网界使用BLAST检索程度实现其用NCBI(National Center for Biotechnology Information)GenBank、意利TigemESTmachine(包括EST提取者EST组装机器)、THC(Tentative Human Consensus Sequences)数据库、ESTBlast检索程序——通英类基组作图项目资源(Human Genome Mapping Project Resource CenterHGMP—RC)服务器访问检序列组装重叠群(contig)重叠群检序列重复进行BLAST检索与序列组装延伸重叠系列重复程直没更重叠EST检或者说重叠群序列能继续延伸获全基编码序列获些EST序列数据再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测假凤精确匹配基EST序列数据据EST六种阅读框翻译蛋白质接着与蛋白质序列数据库进行比较析基析结致三种:第已知基研究象类已鉴定解基;第二前未经鉴定新基;第三未知基部基间同种或异种基匹配新基未知基进步用于物研究
4.2
基电定位
基电定位采用NCBI电PCR程序进行检索寻找EST序列否存序列标签位点(sequence tagged sites,STS)STS作基组单拷贝序列新代遗传标记系统其数目覆盖密度较达平均每1kbSTS或更密集寻找STS与相应染色体相比较即序列定位该染色体
4.3
IMAGE克隆索取
许ESTs所应cDNA克隆通基组及其表达整合析(intergrated molecular analysis of genomes and their expressionIMAGE)协定免疫索取与电基克隆相辅相IMAGE协定由美LLNL家实验室主持宗旨共享排列cDNA文库克隆重规模EST测序项目Merk&Cow公司投资类ESTs项目等都加入IMAGE协定研究者通另外途径基部序列并通同源性检索发现该片段与加入IMAGE协定EST序列高度同源便免费索取其原始克隆通美ATCC组织(American Type Culture Collection)索取避免或减轻筛选全基麻烦集精力进行基功能研究图" class="ikqb_img_alink">

大家好,我最近在克隆一个基因的全长序列,用的是cDS,之前的引物在NCBI上Blast,是特异引物,一开始没有条带,通过不断的试程序,重提RNA等,出现条带了,大小也对,结果测序不是我的基因,然后重新换引物,现在的情况是,51度有我的条带,但是有很多杂带,升高退火温度后,以及减少循环后,啥也没有了,求大神指点。

本人是个菜鸟、设计引物时忘记考虑目的片断大小了!引物已经合成了、才发现克隆基因目的片断大小为180bp左右、是兼并引物来克隆未知基因片断、再做全基因克隆。向大家请教一下,这样做可行吗?是不是片断太小???老板还不知道、估计要废废了。恳请大家多多指教。有没有什么补救的办法?好的建议?????
序列前保留200bp
设计引物候引物度设置25-27左右
辩论稿:克隆的好处与坏处123
梅桂华丽2021-09-01
克隆许优点:
1)克隆技术减轻些能母亲性痛苦
2)克隆实验实施推遗传发展制造物器官移植辟前景
3)克隆技术用于治疗神经系统损伤神经组织再干细胞修复神经损伤
克隆许缺点避免: 1)克隆技术干扰自演化程
2)克隆技术种昂贵技术需要量资金物专业参与失败率高
3)克隆技术应用于体导致代遗传性状工控制4)克隆技术用于创建超或强壮体魄智力迟钝外克隆技术效使用类遗传男性失意义
所说科技双刃剑优点缺点并没标准答案看着使用
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究。
不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。
用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol Ⅲ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol Ⅲ终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)向左转|向右转
请问拓扑异构酶Ⅱ的具体功能有哪些?
拓朴异构酶123
蓝羽443512017-11-07
DNA拓扑异构酶催化反应
很多,其反应本质是先切断DNA的磷酸二脂键,改变DNA的链环数之后再连接之,兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能.然而它们并不能连接事先已经存在的断裂DNA,也就是说,其断裂反应与连接反应是相互耦联的。拓扑异构酶(包括Ⅰ型和II型)都可以用符号转化模型进行解释(下图左中)
除了DNA拓扑异构酶可以产生异构变化以外,很多能够嵌入相邻碱基之间影响碱基堆集作用的试剂,特别是片状的染料分子.也能改变DNA的拓扑状态,最明显的例子就是溴化乙锭(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子与溴化乙锭的结合试验为例,当没有染料时,此DNA为负超螺旋,具有较高的沉降常数(21S);当加入染料分子与核苷酸之比为0.05时,沉降数降至l6S,此时DNA为没有超螺旋的松弛形式;当染料分子和核苷酸的比值增加到0.09时,沉降常数又上升到大约21S,此时DNA分子为正超螺旋。这种关系如上图右所示,不过要注意的是,溴化乙锭并没有改变Lk值,只不过是由溴化乙锭分子的嵌入,增加了局部DNA二级结构的紧缠状态。因而,随着嵌入染料分子数的增多,起初表现为负超螺旋的减少与消失,随后便是正超螺旋的增加。这与单链DNA结合蛋白促进负超螺旋转变为泡状结构的情况是类似的。
拓扑异构酶(topoisomerase):通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键,然后重新缠绕和封口来改变DNA连环数的酶。DNA促旋酶。
DNA拓扑异构酶 DNA topoisomerase
为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应,为了分析体外反应机制,用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中,要暂时的将DNA的一个链或两个链切断,根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶(top- oisomeraseⅠ),通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶(topoisomeraseⅡ)。属于Ⅰ型的拓扑异构酶,有大肠杆菌的ω蛋白(ω-protein,由分子量11万的单个多肽链所成)及各种真核细胞中存在的切断-结合酶(nicking-closing enzyme,分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的)。Ⅱ型拓扑异构酶,有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。另外,噬菌体λ的irt基因产物和噬菌体φX174的基因A的产物等也具有切断—结合酶的活性,可认为是拓扑异构酶之一种。Ⅰ型拓扑异构酶不需要ATP的能量而催化异构体化,作为反应的中间产物,在原核生物来说是游离型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端与酶形成共价键,而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端与酶形成共价键。此酯键中所贮存的能量,可能在切断端的再结合上起着作用。Ⅰ型拓扑异构化酶催化的反应有下列各种:使超螺旋DNA在每一切断—结合反应中,使L数(参见DNA拓扑学异构体)发生一种变化,即松弛(relaxation)(图1)。将互补的单链环状DNA转变成具有螺旋结构的双链环状DNA(图 2),使单链DNA打结(topological knot)或解结(图3)。另外在二个环状双链DNA一个分子的一个链切断时,形成链环状二聚体的分子(ca-tenane)。在Ⅱ型拓扑异构酶中,DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋,这是独特的。其它二个型的酶,除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外,还可催化促旋酶的催化反应。真核细胞的拓扑异构酶Ⅰ,参与核小体的形成,细菌的ω蛋白参与转录和某种转位子的插入。促旋酶和T4拓扑异构酶Ⅱ参与DNA的复制和转录过程。 DNA 拓扑异构酶 I (DNA Topoisomerase I)催化4种反应:①超螺旋的松弛;②绳结(knot)的形成;③环状双链分子的形成;④环状双链分子的连接。本酶由于来源于小牛胸腺,与来源于原核生物的酶性质不同,即使在Mg2+不存在的条件下也显示活性。而且,原核生物由来的DNA Topoisomerase I 只作用负链的超螺旋分子,而本酶则能使正负两方的超螺旋分子均形成松散型。向左转|向右转
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