免疫PCR
| 实验方法原理 | 免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（ProteinA-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19（质粒DNA)(Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。 PCR由以下五部分构成： （1）待测抗原； （2）生物素化抗体； （3）亲和素（连接分子）； （4）生物素化DNA； （5）PCR扩增。 主要程序： （1）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物； （2）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物； （3）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA； （4）PCR扩增生物素化DNA部分。 | ||||||||
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| 实验材料 | 抗原样品 试剂、试剂盒 | 包被缓冲液洗涤液稀释液琼脂糖凝胶 仪器、耗材 | 微滴板电泳仪电泳槽 实验步骤 | 一、制备生物素化DNA 将噬粒BLuescriptskt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bpDNa段，即为生物素化DNA。 二、免疫PCR模式 1. 试剂 包被缓冲液：20mmol/LTris-HCI（pH9.5），含150mmol/LNaCl和0.02%NaN3； 洗涤液：20mmol/LTris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/LEDTA和0.1%Tween20； 稀释液：20mmol/LTris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA（0.1mg/ml）。 2. 操作 （1）包被 用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃过夜（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。 （2）封闭 每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/LEDTA的20mmol/LTris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/LNaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。 （3）抗原抗体反应 用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。 （4）链亲合一蛋白A结合反应 每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。 （5）PCR 实验条件50mmol/LKCI、10mmol/LTris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。 三、PCR周期 PCR前，用紫外线（UV）（254nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5min；30个周期：变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。 1. 用0.85%NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度； 2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl0.85%NaCl于另一孔内）； 3. 用400μl的0.05%温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次； 4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS）PBS封闭2小时； ⒌ 用含0.15%NGS的TPBS洗3次； 6. 加入100μl用0.75%NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30min； 7. 用TPBS洗涤五次； 8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30min； 9. 用TPBS洗涤五次； 10. 加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30min； 11. 用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次； 12. PCR扩增：加入50μlPCR反应液（内含T3和T7引物），95℃60s，50℃110s，72℃110s，循环30次。取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像，进行定量分析。 其他 | 一、发展 免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，还没有一个十分成熟和满意的方法，配套试剂尚缺乏，所以应用的还不多，在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验。Sano，Ruzicka和Hongzhou分别用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重组人原癌基因产物ETS；蛋白作为待检抗原进行免疫PCR，他们的结果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。目前介绍的免疫PCR还存在一些缺点，在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响；同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。另外，有些难于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR检测，连接分子的特异性和均质性对PCR影响很大，从理论上看Hongzhou的生物素标记抗体和DNA以及用游离的链亲和素连接抗体和DNA是一比较理想的方法，但是如能做到生物素化抗体、亲和素和生物素化DNA3个分子预先连接一个复合物，那么将简化实验过程。PCR扩增过程相对简单，如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。固相也可以直接采用某些PCR反应管，并且可以直接用一般的PCR仪进行扩增，但冲洗过程相对复杂一些。免疫PCR具有非广泛的应用前景，十分有必要进一步完善免疫PCR的实验过程和配套试剂的研制。 二、应用 |
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发布于 ： 2021-08-13
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