用 dUTP 净化 PCR 产物的实验
| 试剂、试剂盒 | dNTP溶液MgCl2溶液PCR缓冲液引物尿嘧啶-DNA-糖基酶TaqDNA聚合酶 仪器、耗材 | PCR仪离心管 实验步骤 | 一、材料 1.试剂 （1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每种浓度10mmol/L)多数情况下，直接替换dUTP就可以了（RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的话，为了补偿对聚合酶的抑制作用，dUTP终浓度可提高到0.6~1mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。 （2）MgCl2溶液，50mmol/L 多数情况下Mg2+终浓度达到1.5mmol/L就足够了，然而应根据核苷酸（如dUTP)浓度和引物特异性适当优化。提高核苷酸浓度同时应提高Mg2+浓度。 （3）PCR缓冲液，10X(100mmol/LTris-HCl,pH8.4,500mmol/LKCl） 2.引物 正向引物（l0umol/L) 反向引物（l0umol/L) 3.酶 （1）尿嘧啶-DNA-糖基酶，1U/ul（Invitrogen) 1UUDG可以去除5ng污染物，根据要求的净化程度可以减少到0.01活性U(KoxetaL1994)B（2）TaqDNA聚合酶5U/ul 热启动Platinum7"叫DNA聚合酶Invitrogen10966-018)允许在室溫条件下准备PCR反应液。 4.设备 可以设定程序（注意在「二、方法」中的（3）和（4）有修改）的PCR仪、PCR扩增用薄壁离心管。 二、方法 （1）在灭菌的离心管中于冰上加入下列试剂。 10xPCR缓冲液 5ul dNTP溶液 1ul 注：dNTP溶液，含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP,每种浓度10mmol/L 正向引物、反向引物 1ul（每种l0umol/L）尿嘧啶-DNA-糖苷酶1U/ul 1U TagDNA聚合酶（5U/ul） 0.5ul MgCl2(50mmol/L) 1.5ul H20 40ul （2）37°C温育l0min。 这一步UDG可以从污染物中去除屎嘧啶残基。据报道这一净化过程也可以在室溫条件下完成（dcWitetal.1993；Wangetal.1992). （3）94°C加热l0min,失活UDG并水解污染的DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。 （4）在标准PCR基础上增加2个循环。 增加2个循环可以补偿dUTP对扩增效率的影响（Longoetal.1990)。 （5）在PCR结束之前，将温度保持在72°C,直至储存。 据报道，PCR结束后如果降低温度，大肠埃希菌UDG会恢复一小部分催化活性。 （6）把含尿嘧啶DNA以及含有UDG活性的反应混合物-20°C保存。 |
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发布于 ： 2021-09-01
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