FDDPCR 实验
| 试剂、试剂盒 | CDNA矿物油 仪器、耗材 | 热循环仪薄壁PCR管 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 矿物油（可选） 2.核酸和寡核苷酸 来自方案3的cDNA 3.专用设备 热循环仪[推荐使用GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer)，或者Mastercyder(EppendorfScientific)] 0.2ml薄壁PCR管 4.附加试剂 RNAspectraFluorescentmRNA差异显示系统（GenHunterF501~F510&R501-R510)，包括蒸馏水、10XPCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl2,0.01%明胶）、FDDdNTP混合液（2.5mmol/L)、荧光锚定引物（FH-TUM)(2umol/L)以及任意引物（H-AP)(2umol/L) 二、方法 1.在不同的1.5ml离心管中，为每个FH-TUM锚定引物单独配制一个FDD-PCR主体混合液。 蒸馏水 91.8ul 10XPCR缓冲液 18.0ul FDDdNTP混合液 14.4ul FH-T11M引物（M=G、A或C) 18.0ul TaqDNA聚合酶（Qiagen201207Valencia，CA)1.8ul 2.将热循环仪的程序设置为：94°C15s→40°C2min→72°C60s→40个循环→4°C平衡。 如果使用的不是推荐的热循环仪，那么将变性（94°C)"时间调整为30s。 3.各取16ul相应的FDD-PCR主体混合液，加到标记好的0.2ml薄壁PCR管中。例如，将8个管子标记为锚定引物FH-T11G与任意引物H-AP1~8的组合，同样标记好所有的24个引物组合，包括FH-T11A与H-AP1~8和FH-T11C与H-AP1~8。 4.在每个0.2mlPCR管中，加入2.0ul相应的cDNA(来自方案3的RT反应）。 5.在每个0.2mlPCR管中，加入2.0ul相应的H-AP,混匀，总反应体积为20ul。如果需要，加入25ul矿物油。 6.将0.2mlPCR管放到热循环仪中，开始运行程序（见第2步）。完成后，反应产物在黑暗中-20°C保存。 |
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发布于 ： 2021-09-20
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