实验方法原理 | |||||||||||
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实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | PBS适用于样品细胞的培养液裂解液在15cm培养血的单层培养细胞双份样品100%硫酸二甲酯(DMS)缓冲液平衡酚25:24:1(VVV)酚氯仿异戊醇24:1(VV)氯仿异戊醇 仪器、耗材 | 50mL和15mL一次性使用的螺口聚丙稀管(如Corning)带废液瓶的抽气装置一次性细胞刮子台式离心机(如IECCentra-7R)1.5mL硅化的微量离心管带管扣封堵的巴斯德吸管或细玻璃棒 实验步骤 | 1)在实验前先准备好以下溶液:在置于通风橱的37℃水浴中预热的PBS(约75mL/15cm培养皿);将每份24mL细胞培养液加入到50mL的一次性使用螺口聚丙烯管中,与PBS—样在37℃水浴预热。配制裂解液。 2)对于对照(未处理的)细胞:弃去15cm组织培养皿中的培养液,迅速加入约25mL预热的PBS,轻轻晃动几次,倒掉PBS。立即进行步骤5。 3)对于体内DMS处理细胞:弃去15cm组织培养皿中的细胞培养液。取24μL100%DMS加至每份预热的培养液中(DMS终浓度0.1%),旋上盖子,倒转几次以混匀,然后将全部液体加入到组织培养皿中,让含0.1%DMS的培养液与细胞接触恰好2min。 临用前才加入DMS,培养液中的水会很快使之失活。可通过调整温育的时间和(或)DMS的浓度,以得到最适的DMS足迹。 4)用带废液瓶的抽气装置,吸出并弃去含0.1%DMS的培养液。轻轻地加入约25mL预热的PBS于细胞培养皿中,轻轻混合几次,然后吸去PBS。用预热的PBS如此反复洗培养皿3次,每次PBS在细胞上应停留30s左右。 5)对于处理的和未处理的细胞:尽量吸尽PBS,然后加入1.5mL裂解液,轻轻摇动使裂解液均匀地布满整个细胞层的表面,室温放置约5min。 6)倾斜培养皿,然后用一次性细胞刮子将DNA细胞裂解液刮下,用吸管尽可能将裂解物全部转移至1个15mL聚丙烯管中。 7)细胞裂解液在37℃温育3〜5h,每隔30〜60min混合1次。温育过程中,用蛋白酶K消化细胞蛋白质。结束温育后,样品可在-20℃无限期储存,在使用之前应先融化并使其温度至室温。 8)加入1.25倍体积的缓冲液平衡酚,轻轻颠倒30次充分混匀。在台式离心机上室温1300g(在IECCentra-7R离心机上为2500r/min)离心10min。用23cm的巴斯德吸管穿过水相和界面插至管底,吸去底层的酚。如果黏性的DNA被带至有机相,可用吸头吹出空气气泡而使其分离。不要触动界面,因为在界面处有许多DNA。用酚重复抽提1次。 9)加入1倍体积酚/氯仿/异戊醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。室温500g(在IECCentra-7R离心机上为1500r/min)离心10min,如步骤8用23cm的巴斯德吸管头从底部吸走酚/氯仿/异戊醇。勿触动界面,重复此抽提步骤1次。 10)加入1倍体积的氯仿/异戊醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。室温200g离心5min,如步骤8用巴斯德吸管从底部吸走氯仿/异戊醇溶液。 11)加入1倍体积乙醚,轻轻颠倒约30次重复混匀。通过重力作用使其分层(约1min),用一根巴斯德吸管吸取乙醚(上相),在通风橱中使所有残余的乙醚完全挥发(约5min)。 12)加入1倍体积异丙醇,轻轻颠倒约30次使其混合完全。 13)将纤维状的DNA沉淀缠绕在已封堵的23cm长的巴斯德吸管上或细玻璃棒上,小心地从异丙醇溶液带出,将DNA轻压试管内壁使多余液体流去。 14)将缠绕着的DNA置于3mLpH7.5的TE缓冲液,室温下轻轻摇数小时至过夜使DNA重新溶解。 15)加入330μL3mol/L乙酸钠和6.7mL冰冷的100%乙醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。如步骤12和13,重新沉淀和缠起DNA。 16)将缠绕着的DNA置于200〜500μLpH7.5的TE缓冲液,室温放置过夜或4℃放置数天,在此过程中不时地轻轻颠倒几次,使DNA重新溶解。溶解完全后,用分光光度计测定DNA浓度,并将其浓度调为0.5〜1mg/mL,储于4℃。对照DNA(没有用DMS处理)质量应较高,此时可用于基因组测序和基因组甲基胞嘧啶分析(GarrityandWold,1992)。 17)将约75〜175μL对照DNA加入到一个硅化的1.5mL微量离心管中,加入TE缓冲液至175μL 18)在495μLH2O中加入5μL100%DMS得到1%DMS溶液,振荡25s充分混匀,稍加旋转离心,收集液滴。DMS应试几个不同的浓度,以确定与用于步骤3和4的体内条件最为匹配的条件。 19)加入25μL1%DMS溶液于对照DNA中,轻轻颠倒约25s充分混匀。避免DMS溶液粘在管盖上,如有黏附,可稍加旋转离心。室温温育恰好2min,然后加入50μL冰冷的DMS终止缓冲液。立即加入750μL在干冰上预冷的100%乙醇,剧烈摇动使其混合,将管子插入碎干冰中,让样品在干冰上放置约30min。 20)与体外DMS处理的样品平行,制备经体内处理的DNA待哌啶处理。将200μLDNA(来自步骤16)与50冰冷的DMS终止缓冲液混合,在涡旋混合器上稍加振荡(3s)。加入750μL冰冷的100%乙醇,剧烈摇动混合。将管子插入干冰中,让样品在干冰上放置约30min。 21)将两种DNA沉淀样品(来自步骤19和20)4℃离心l0min,弃上清。将沉淀加入1mL室温的75%乙醇,在涡旋混合器上稍加振荡(5s)直至沉淀离开管壁。4℃离心10min,弃上清。 22)用水按1:10稀释哌啶至终浓度为1mol/L,往每种DNA沉淀中加入200μL。室温下温育以重溶DNA,并间或在涡旋混合器上振荡。沉淀通常可在15min左右溶解。仔细检查样品确定DNA已完全溶解,没有溶解的沉淀在1mol/L的哌啶中会形成小透镜状的清晰漂浮物。注意:应在通风橱中分装哌啶。 23)当沉淀已完全溶解,稍加旋转离心以收集液滴。扣上管扣,在通风橱中于90℃加热30min。用哌啶加热处理可以使基因组DNA在甲基化的鸟嘌呤处断裂,使DNA变性并破坏污染的RNA。 24)打开管扣,稍加离心以收集冷凝液滴。置样品于干冰上冷却10min。用Speedvac真空旋转蒸发器在室温蒸发1〜2h,除去哌啶。 25)沉淀用360μLpH7.5的TE缓冲液重悬。加入40μL3mol/LpH7.0的乙酸钠,在涡旋混合器上振荡混匀;加入1mL冰冷的100%乙醇,剧烈摇动以充分混匀,-20℃至少放置2h以上。 26)样品在4℃离心15min,弃上清。沉淀用pH7.5的TE缓冲液500μL重悬,加入170μL8mol/L乙酸铵,在涡旋混合器上振荡混匀;加入670μL异丙醇,剧烈摇动以充分混匀,-20℃放置至少2h。 27)样品在4℃离心15min,弃上清。加入500μL室温的75%乙醇,在涡旋混合器上振荡,样品在4℃离心15min,弃上清,并用吸管吸去残余的痕量乙醇。 28)沉淀用50μL水重悬,然后在Speedvac蒸发器中干燥1h。重新溶解沉淀于TE缓冲液中,使DNA终浓度约为1μg/mL。 29)样品在室温离10min,将上清液转移至一个新的经硅化的微量离心管中,如有胶状沉淀存在,弃去。用分光光度计对DNA定量,并用pH7.5的TE缓冲液将浓度调至0.4μg/μL,此时的样品可用于连接介导PCR。 注意事项 | 其他 | |