一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

灭菌双蒸水（ddH₂0)

10mmol/LTris-HCl，pH8.0

2.酶和酶缓冲液

限制性内切酶和缓冲液（见第9步）

10XVent缓冲液

VentDNA聚合酶

3.核酸和寡核苷酸

生物素标记的PCR引物，长度至少15bp,5"末端进行了生物素修饰（见图26-1)。



编码12个氨基酸的NNK库。库的设计如图26-1(a)所示。

合成的链含有一个随机多肽库，它们的3"末端和5‘末端都加了一个特定的侧翼序列，作为引物结合的位点，并且含有限制性内切酶的识别位点，以方便将文库DNA克隆进合适的载体系统。侧翼序列长度至少应该有15bp，并且设计时应该有3个标准：1.它们应该是有效的PCR引物结合位点；2.它们应该含有后续克隆步骤所需的限制性酶切位点（可选：限制性酶切位点可以位于PCR引物5’端与文库寡核苷酸的重叠区，而不要位于文库寡核苷酸内部），3.因为一端或两端的便翼DNA序列有可能在肽库中代表氨基酸，它们应该不包含影响文库功能的密码子。在合成文库的编码区过程中，每个密码子的前两个位点中，4种核苷酸的含量是相等的，而在第三个位点，G+T的比例是1:1[图26-1（a)]。在第三个位点不使用A和C核苷酸，减少了形成终止密码子的可能，但仍允许编码20种氨基酸。

dNTP(各20mmol/L)

4.其他

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭(见第11步）

QIAprepMiniprepsilicacolumn(Qiagen)

链霉抗生物素蛋白磁性珠（Dynal)

二、方法

1.第一轮聚合反应：文库的PCR扩增

（1）进行下列反应，将单链的合成寡核苷酸，扩增为有效的构建文库的起始材料。下面所给的是100ul体系的用量。要构建大规模的库，准备1ml的反应物，并将它们平分到10个独立的PCR管中。

10pmol的文库寡核苷酸

2U的VentDNA聚合酶

生物素标记的PCR引物，各100pmol

10ul的10XVent缓冲液

dATP、dCTP、dTTP和dGTP，各1ul

用ddH₂O定容至100ul

（2）在一个热循环仪中，94°C将混合物预热20s。

（3）按下面的参数进行30轮PCR循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

（4）冷却至4°C。

2.第二轮聚合反应：合成配对的双链文库DNA.

（5）在每100ul第一轮反应产物中，加入10ul的10X反应缓冲液、100pmol的各引物、2U的VentDNA聚合酶。

（6）进行一个单轮的循环：94°C30s，55°C30s，72°C15s。

（7）冷却至4°C。

（8）用QIAprep的柱子纯化第二轮扩增产物，并用10mmol/LTris(pH8.0)洗脱。

（9）用合适的内切酶消化洗脱产物（图26-2，第1泳道），然后用乙醇沉淀DNA,并用ddH₂O溶解（SambrookandRussell2001)。经过这一消化反应，生物素标记的DNA末端将从文库的核心释放出来。

（10）用链霉抗生物素蛋白磁性珠去掉生物素标记的DNA末端（Kornetal.1992)。这一步骤将增加目的连接产物的产量，因为这些末端能够与文库插入片段或表达载体相连接。链霉抗生物素蛋白的亲和步骤，同时能去掉任何没有酶切或部分酶切的PCR产物（图26-2,第3泳道和第4泳道）。

（11）在4%的琼脂糖凝胶上，分析反应中间产物和终产物。终产物（图26-2,第4泳道）是高纯度且高度复杂的双链文库DNA，有突出的末端，可以直接连接到合适的表达系统上。