原核细胞 l用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建 1.PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段,片段5’端和3’端带有与IPTG诱导表达载体对应的限制酶位点。 2.含靶CDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。 3.重组质粒转化有lacIq等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有lacI基因,可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄(50μg/ml)的LB平板,于37℃过夜培养。 4.通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。 诱导靶蛋白表达的优化 许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。 5.对照菌和重组菌分别挑取1~2个菌落,接入1ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养液,适当温度(20~37℃)培养过夜。 大肠杆菌在室温的生长速率比在37℃慢4倍,所以~20℃培养过夜(16h)可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢,不容易形成包涵体。 6.取50μl过夜培养物接入5ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养液,20~37℃振荡培养2h以上,至对数中期(A550=0.5~1.0)。 7.吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤9和10所述进行处理。 8.在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L,20~37℃继续通气培养。 IPTG的浓度对表达水平影响非常大。1mmol/L只是一个起点,也是一个比较高的浓度。实验中,应在0.01~5.0mmol/L的范围内改变IPTG浓度,寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白,必须诱导表达质粒慢转录,才不致于使细菌的生物合成系统过载。 影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度,通过实验确定最佳温度,是表达外源蛋白的关键。虽然在15~42℃之间都获得过成功表达,但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄,只有2~4℃。温度有时对表达水平起着决定作用,而有时却对表达水平没有任何影响,这其中的原因还有待进一步研究,但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括:细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基(血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等)的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌SOS修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在,理论推断最佳生长温度是不可靠的,必须进行反复的实验。 9.在诱导的不同时间(如1、2、4和6h)取1ml样品放于微量离心管中,测定A550,室温高速离心1min。 10.沉淀悬于100μl1×SDS凝胶加样缓冲液,100℃加热3min,室温高速离心1min,冰上放置,待全部样品处理完后上样。 11.样品加热至室温,取40μg或相当于0.15OD550培养物的悬液上于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶。 12.8~15V/cm点泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。 13.考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带。 37℃诱导30min的阳性对照,有一条分子质量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)带,GST的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带,诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于GST对照。 大量表达靶蛋白 14.挑取一个重组大肠杆菌菌落接入50ml含氨苄(50μg/ml)的LB培养液,在250ml摇瓶中于20~37℃过夜培养。 15.取5~50ml过夜培养物接入450~500ml含氨苄(50μg/ml)的LB培养液,在2L摇瓶中于20~37℃振荡培养过夜,至对数中期(A550=0.5~1.0)。 16.以预试验确定的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。 17.诱导适当时间后,于4℃以5000g(5500r/minSorvallGSA转头)离心15min收集细胞,继续后面的纯化方案。 l用T7噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建 1.PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段,片段5’端和3’端带有与T7噬菌体启动子表达质粒(如pET载体;Studieretal.1990)对应的限制酶位点。 2.含靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。 3.连接产物转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3)或BL21(DE3)。将转化体铺于含氨苄(50μg/ml)的NZCYM平板,于37℃过夜培养。 4.通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。 诱导靶蛋白表达的优化 许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。 5.对照菌和重组菌分别挑取1~2个菌落,接入1ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的NZCYM培养液,37℃培养过夜至饱和。 6.取50μl接入5ml含氨苄青霉素(50μg/ml)NZCYM培养液,在50ml摇瓶中于37℃培养2h。 7.吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤9和10所述进行处理。 8.在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L,20~37℃继续通气培养。 9.在诱导的不同时间(0.5、1、2和3h)取1ml样品放于微量离心管中,测定A550,室温高速离心1min。 10.沉淀悬于100μl1×SDS凝胶加样缓冲液,100℃加热3min,室温高速离心1min,冰上放置,待全部样品处理完后上样。 11.样品加热至室温,取40μg或相当于0.15OD550培养物的悬液上样于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶。 12.8~15V/cm电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。 13.考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带。 大量表达靶蛋白 14.挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入50ml含氨苄(50μg/ml)的NZCYM培养液,在250ml摇瓶中于37℃过夜培养。 15.取5~50ml过夜培养物接入450~500ml含氨苄(50μg/ml)的NZCYM培养液,在2L摇瓶中于37℃振荡培养至对数中期(A550=0.5~1.0)。 16.以预试验确定的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。 17.诱导适当时间后,于4℃以5000g(5500r/minSorvallGSA转头)离心15min收集细胞,继续后面的纯化方案。