【求助】能否在普通PCR仪上摸索realtimePCR反应条件?
2021-07-28
问题描述:
由于自己实验室没有realtime-PCR的仪器,所以要到别的实验室做,但是每次操作的费用比较高,而自己的实验室有普通PCR的仪器,所以我想问下我能否在普通的PCR上用realtime-PCR的试剂(SYBRgreen)和引物先摸索合适的反应条件,然后再应用到realtime-PCR的仪器中?如果可以需要注意哪些方面呢?非常感谢!:)
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sammyliang
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找到最适合的退火温度即可,可以用普通pcr仪摸索。上机的时候要注意你用sybr green是谁家的,不同的家程序不同,如abi金牌酶。
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好小猫
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楼主可怜,想起以前我做实验时的可怜情境了。可以的,加入染料扩增,普通电泳检测,条件摸好后,上real-time试一下,问题不大就直接用,或者微调一下,一般没问题的
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leomed
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我之前有用普通的pcr试剂试P过,条带很亮的,但是我今晚用sybrgreen(Takara公司的)试做了下,条件是按说明书上的,结果条带有,但是很模糊,不过我凝胶没加EB,不懂是不是这个原因,我原来是想sybrgreen也是在DNA双链合成时嵌入进去的,而EB也是嵌入双链中,用了sybrgreen是不是EB就没法嵌入了,所以没加EB,而sybrgreen本身也是荧光,是否这样?
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JIAOYUE
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虽然染料中有SYBR,但是最好在凝胶中也使用EB进行染色。
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sammyliang
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eb是结合dna大沟,sybergreen结合dna小沟,灵敏度后者高出很多啊。
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好小猫
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楼上几位说了,就不在赘述了
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leomed
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各位大侠,请问你们有这样做过么,效果如何?有个问题,realtime-PCR在做完扩增曲线后就直接做溶解曲线了,而在普通PCR仪上最后一个循环完成后参数是怎么设置呢,直接转4度还是?
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dyhvs
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一般都加一个终延伸的,同循环中的延伸温度,只是时间加长。
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leomed
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虽然没在普通PCR仪上得到好的结果,不过很感谢各位战友的帮助,而且很高兴的是已经在realtime-PCR仪上摸好反应条件了。
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yaxiao_999
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我也是楼主一样的条件,可以在普通的机子上摸索一下,但到定量上还是要调一下
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