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细胞介导的细胞毒作用(CMC)检测法:细胞的制备
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CMC中效应细胞的制备

1)用淋巴细胞分离液分离PBMC

1.抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中,加2倍量磷酸盐(PBS)悬浮细胞。将此悬液小心加在淋巴细胞分离液上,400×g离心30分钟。

2.离心后红细胞在管底,PBMC在血浆和淋巴细胞分离液的交界面。收集PBMC,用PBS洗涤细胞两次,每次离心150×g10分钟。低速离心可以减少血小板沉淀,但细胞沉淀物较松散,去上清液时注意丢弃细胞。

3.将细胞悬浮于含2%~5%人AB血清RPMI-1640培养液中,计数细胞,用1%台盼蓝染色检测细胞活力(应>90%),再用同样培养液将细胞配成1×1062×106/ml

2)分离大颗粒淋巴细胞

1.配制不连续Percoll梯度:取Percoll原液与10倍浓缩的PBS91的比例混合,此时溶液为100Percoll,比重是1.127,毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg。将100Percoll与含0.75%牛血清蛋白的RPMI-1640培养液混合配成41.1%、45.8%、50.0%和66.6%的Percoll溶液。在41.4%和50.0Percoll溶液中加一滴0.1%台盼蓝,以便区分个梯度溶液的交界面。

2.50ml离心管中从下向上依次小心加入66.6%、50.0%、45.8%和41.1%的Percoll溶液各10ml,使分别形成明显的交界面。再小心加水10ml约含5×108PBMC的细胞悬液。水平离心500×g30分钟。

3.分别收集各交界面的细胞,用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次,每次离心500×g10分钟。用含2%~5%人AB血清的RPMI-1640培养液将细胞配成适当浓度。LGL的密度较低,主要在41.4%和45.8%的交界面。50%和66.6%交界面细胞主要是T细胞,45.8%和50%交界面细胞是T细胞和LGL的混合物。三个交界面中的细胞都有LAK活性。

3)其它来源的效应细胞

1.无菌摘取胎儿胸腺、胎肝、胎脾或肿瘤的引流淋巴结,置含2%~5%人AB血清的RPMI-1640培养液的平皿中。

2.在无菌操作下,用注射器芯将上述器官挤压通过200目的钢丝网,得到单个细胞。用上述培养液洗涤细胞一次。

3.将细胞悬浮于上述培养液中,计数细胞,用台盼蓝染色检测细胞活力(应>80%),再用同样培养液将细胞配成1×1062×106/ml

4LAK细胞的诱生和扩增

1.向上述各种来源的淋巴细胞悬液中加重组IL-21000U/ml。以2×106/ml的细胞浓度,在375CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养35天,细胞即具有LAK活性。

2.培养35天的LAK细胞数量基本没有变化。如需较多的LAK细胞,可以继续培养至23周:每当细胞生长到5×10610×106/ml时分瓶,用同样培养液将细胞配成1×1062×106/ml,再加IL-2继续培养。

靶细胞的制备(分离肿瘤细胞和TIL

1.无菌摘取肿瘤,置预冷的含抗生素RPMI-1640培养液中,剪去结缔组织,剪碎瘤体至12mm大小。放置210分钟让组织块沉淀,吸去上清液。

2.将沉淀的组织块置510倍体积的消化液中,37℃中搅拌或振荡14小时或室温过夜。用力吹打组织块,即可得到单个细胞悬液。

3.离心400×g10分钟,除去消化液。用5倍体积的RPMI-1640培养液悬浮细胞。将细胞悬液小心加到双层淋巴细胞分离液上。

4.离心400×g30分钟,上层分界面是新鲜肿瘤细胞,下层分界面是肿瘤组织中的淋巴细胞(TIL),可用于诱导杀伤活性和扩增。

5.RPMI-1640培养液洗涤肿瘤细胞两次,用作检测LAK细胞活性的靶细胞。此细胞可以在含50%人AB血清和10%二甲基亚砜(DMSO)的RPMI-1640培养液中以1×1075×107/ml的浓度置液氮中冻存,用前复苏。

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