Artikelnummer | KTC4004-1 |
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Artikelgruppe | Zellfärbekits |
Artikelbezeichnung | TraKine Mitochondrion Staining Kit (Orange Fluorescence) |
Spezies-Reaktivität | Mammalia |
Spezifität | Mitochondrien |
Anwendung | Durchflusszytometrie (Flow Cytometry), Immunfluoreszenz |
Beschreibung | gleichmäßige Färbung der Mitochondrien von Säugerzelltypen, kann für lebende und fixierte, suspendierte oder adhärente Zellen verwendet werden |
Inhalt | Assaypuffer (10×), MitoOrange (1000×) |
Zweckbestimmung | nur für Forschungszwecke |
Temperatur - Lagerung | gekühlt, komponentenspezifisch |
Temperatur - Transport | gekühlt |
Packungsgröße | 100 Tests |
Hersteller / Marke | Abbkine Scientific |
- KTC4004-1 – Datenblatt
Abbkine Mitochondrion Staining Kits are a set of fluorescence imaging tools to label mitochondria of live cells. This kit uses a proprietary mitochondrial orange fluorescent probe (Ex/Em=579/599 nm), which, like other probes, the kit uses a proprietary dye that selectively accumulates in mitochondria probably vial the mitochondrial membrane potential gradient. MitoOrange, a hydrophobic compound, easily permeates intact living cells and can be retained after formaldehyde fixation and permeabilization. The dye is suitable for double labeling experiments, and its orange fluorescent probes is well distinguished from other green fluorescent probes. The fluorescence can be measured using fluorescence imaging, high-content imaging, microplate fluorometry, or flow cytometry. This kit is suitable for proliferating and non-proliferating cells, and can be used for both suspension and adherent cells.
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产生 DNA 指纹图谱的主要试剂及器材如下:限制性内切酶 HinfⅠ、HaeⅢ等;电泳级琼
脂糖;尼龙膜;λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ;H4 型(24×20cm)水平电泳槽装置;Model 250 型
电泳仪;标记试剂盒 Prime-a-Gene® Labeling system;(α-32P)dCTP;X 光胶片;LS5801
型液闪仪;FYY-1 型多功能生化反应仪。
2.2 有关试剂的配制
(1) ACD 抗凝剂
柠檬酸 0.48g
柠檬酸钠 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至 100ml
(2) T10E10 缓冲液
Tris-HCl 10mmol/dm3
EDTA 10mmol/dm3
pH 值:8.0
(3)TE 缓冲液
Tris-HCl 10mmol/dm3
EDTA 1mmol/dm3
pH 值:8.0
(4)20%SDS(100ml)
SDS 20g
溶于 100ml 蒸馏水中,30℃以上贮存。
(5)USSTE 裂解液
Urea 8mmol/dm3
NaCl 0.3mol/dm3
SDS 2%
Tris-HCl 150mmol/dm3
EDTA 1mmol/dm3
pH 值:7.5
(6)Tris 饱和酚
新蒸苯酚加入 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1%,用 1mol/dm3 Tris-HCl 和0.5mol/dm3
Tris-HCl 溶液饱和至 pH 值 8.0,去掉上层水相,加适量(约 1/10 体积)的 0.1mol/dm3 Tris-HCl
(pH 值8.0)覆盖在酚相上,保持4℃,放在棕色瓶中保存。
(7)50×TAE 缓冲液(1 000ml)
Tris 242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol/dm3 EDTA(pH 值 8.0) 100ml
(8)10× BPB 贮存液
聚蔗糖 20%
EDTA 0.2mol/dm3
溴酚蓝 0.25 %
二甲基腈蓝 0.25%
本贮存液可在室温存放。
(9)40mmol/dm3 亚精胺
亚精胺 0.58g
将亚精胺溶于 10ml 蒸馏水中,4℃下存放。
(10)溴化乙锭(EtBr)贮存液 (10mg/ml)
EtBr 1g
将EtBr 溶于 100ml 蒸馏水中,在棕色瓶存放,温度保持在 4℃。
(11)变性液
NaCl 1.5mol/dm3
NaOH 0.5mol/dm3
(12)20×SSC(1 000ml)
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
用 10mol/dm3 NaOH 调 pH 值至 7.0,高压灭菌。
(13)杂交液
NaPO4 0.5mol/dm3
SDS 7 %
EDTA 1mmol/dm3
(14)标记反应终止液
聚葡萄糖蓝 0.9%
溴甲酚紫 0.03%
EDTA 20mmol/dm3
4℃下存放。
(15)SephadexG-50 的水化
SephadexG-50 10g
将 SephadexG-50 溶于约 300ml TE(pH 值 8.0)中,高压灭菌,4℃下存放。
(16)闪烁液(500ml)
无水乙醇 10ml
PPO 2g
PoPoP 50mg
二甲苯 490ml
室温棕色瓶存放。
2.3 操作步骤
2.3.1 基因组DNA 的提取
(1)10ml 全血与 40mlT10E10 缓冲液混匀,4 000r/min 离心10 分钟。
(2)弃上清液,在沉淀中加入 40mlT10E10 缓冲液混匀,4 000r/min 离心 10 分钟。
(3)弃上清液,在沉淀中加入 40mlTE 缓冲液混匀,4 000r/min 离心 10 分钟。
(4)弃上清液,在沉淀中加入10mlUSSTE 裂解液,混匀呈浊液,置摇床过夜,温度保持
在37℃。
(5)加入 10ml 苯酚,缓慢上下混匀至少 20 分钟,4 500r/min 离心 20 分钟。
(6)用移液枪小心地将上层水相转移到另一离心管中,吸头的尖端剪去一小段,以免在
吸取过程中损伤大分子DNA。
(7)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(体积比为24:23:1),缓慢上下混匀15
分钟,4 500r/min 离心20 分钟。
(8)如前述吸出水相,向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇(23:1),上下缓慢混合10
分钟,4 500r/min 离心 20 分钟。
(9)吸出水相,向水相中加入2 倍体积的预冷(—20℃)无水乙醇,盖紧管盖,上下颠
倒即可看见白色絮状DNA。
(10)小心将絮状DNA 吸(吸头尖端剪去一小段,端部必须光滑)至1 .5ml 离心管中,加
入 1ml 70%的乙醇,来回颠倒数次离心管,10 000r/min 离心 2~5 分钟。
(11)小心地倒掉管中乙醇,将管倒置在干净的吸水纸上,以让乙醇流尽。
(12)将离心管正立,置45℃烘箱中烤20 分钟左右,以便让乙醇完全挥发掉,如有条件,
可置于真空干燥器中抽气10 分钟。
(13)取出离心管,视沉淀块的大小加入 100~200μl TE 缓冲液,置55℃水浴中过夜,以
溶解 DNA。
(14)将溶解后的 DNA 置于 4℃或—20℃下贮存。
2.3.2 基因组DNA 的酶切
(1)每样酶切反应为:
10μg DNA
1.5ml(15u) 限制性内切酶
6μl 10 倍 buffer
6μl 40mmol/dm3 亚精胺
加双蒸水至体积为60μl,用吸头混匀。
(2)37℃水浴,保持6~8 小时。
(3)取出酶切样品置于4℃下。
2.3.3 基因组DNA 酶切情况检查
(1)从每个酶切样品中取出3μl 消化液,加入3μl 2 倍BPB 混匀后点样。
(2)用 0.8%琼脂糖凝胶(内含 0.5μg/ml EtBr)和 1 倍TAE 缓冲液进行电泳,电压为60V。
(3)1 小时后,在紫外灯下检查酶切是否完全及各样品的DNA 浓度是否一致,以确保每
个样品进行电泳时上样量一致。
(4)如果发现某个样品酶切不完全,则另外加入5μl 左右的酶,在37℃条件下水浴保温6 小时。
(5)已完全酶切的样品,加入1/10 体积(6μl)的电泳上样缓冲液(10 倍BPB),混匀
后置4℃(短期)或—20℃(长期)保存。
2.3.4 大板凝胶的制备和电泳
(1)称取3.75g 琼脂糖,将其倒入一个500ml 容积的普通试剂瓶(透明度要高)中。用
蒸馏水将50 倍TAE 贮存液稀释成1 倍TAE, 量取375ml 1 倍TAE 加入瓶中, 配制的凝胶
浓度为 1.0% 。
(2)盖上瓶盖,但不能旋得太紧。将瓶放入微波炉中加热,待琼脂糖完全熔化后,溶液
是透明的。
(3)取出瓶子放在55℃的水浴箱中,约30 分钟后就能冷却至55℃。
(4)洗净并擦干制胶板(24cm ×22cm),用 2cm 左右宽的透明胶布将制胶板的两个开口
端封牢,放置在水平台面上用水平仪调平。将样品梳( 6mm × 3mm )插入制胶板离最近开口
端 2cm 位置。将冷却至55℃的凝胶摇匀,缓慢地倒入制胶板中央,如果有气泡出现,应用吸
头将气泡吸掉,60 分钟后,制胶板中的凝胶将完全凝固。
(5)将 50ml 50 倍 TAE 贮存液倒入电泳槽中,再加入 2 450ml 蒸馏水与其混匀,电泳槽
也应置于水平台面上。
(6)将制胶板两端的透明胶布剥离,然后将制胶板放在电泳槽的中部,小心地拔出加样
梳,以免加样孔破裂。
(7)从 4℃冰箱中取出 DNA 样品,另取两个离心管,各加入 12μl(1μg/8μl)的分子量
标志物λDNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ 及 1/10 体积的(1.2μl)10 倍 BPB,混匀。将 DNA 样品及
分子量标记物一起置于55℃水浴箱保温10 分钟,取出后立即置于冰水混和物中,2~3 分钟后
点样,这样可防止粘性末端之间的粘接。
(8)加样时每个样品用一个吸头,以免交叉污染。吸出样品后应迅速插入加样孔中下部,
轻轻推出样品,在两端加样孔中各点入分子量标志物。
(9)盖上电泳槽盖,插上导线,在加样后5 分钟接通电流,以留出时间使加样孔内的样
品通过扩散而均匀分布,将电压调至30V,电泳60 小时。
2.3.5 Southern 转移
(1)电泳结束后,将制胶板连同凝胶一起放在一个方形塑料盘中,倒入约350ml(浸没凝
胶)的 0.2mol/dm3HCl 处理 25 分钟,并每过约5 分钟摇动一次。
(2)倒掉稀盐酸溶液,加入蒸馏水简单地洗涤一下凝胶,然后倒掉蒸馏水,加入约350ml
的变性液浸泡30 分钟,间断性地摇动。
(3)倒掉变性液,加入350ml 0.5 倍变性液浸泡 25 分钟,间断性地摇动。
(4)将制胶板连同凝胶一起取出,将一块约28cm×19.5cm 的玻璃板盖在凝胶上,极其小
心地将制胶板倒翻过来,这时玻璃板在下,凝胶在上,轻轻地滑出制胶板,将玻璃板连同其
上的凝胶放在水平的桌面上。
(5)将一张20cm×19cm 的尼龙膜(注明样品排列方向及电泳方向)在0.5 倍变性液中浸
湿,然后对齐凝胶小片段区域的顶端将尼龙膜铺在凝胶的表面,用一根玻璃棒从膜的表面推
过以赶走膜与凝胶之间的气泡,用墙纸刀切除掉凝胶的无用部分(未被尼龙膜覆盖住的部
分)。操作时应戴上手套或用镊子。
(6)将3 张稍大于膜的滤纸(20cm×20cm)依次在 0.5 倍变性液中浸湿,放置在膜上,每
放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
(7)将一打(约4~5cm 厚)已裁至滤纸大小的干吸水纸放在滤纸层上,再将一块玻璃板
放在吸水纸上,然后抓紧上下两块玻璃板迅速翻转放在水平桌面上,抽去凝胶上面的玻璃板。
(8)在凝胶的四周露出的滤纸及吸水纸上放上保鲜膜,以防止凝胶上下的滤纸直接接触。
然后将 5 张稍大于凝胶的滤纸(20cm ×20cm)依次在 0.5 倍变性液中浸湿,放置在膜上,每
放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
(9)用一层保鲜膜将整个转移装置围盖住,以防水分蒸发,将一块玻璃板压在顶部。
(10)持续转移3~4 小时后,去掉上面的滤纸和凝胶,取下尼龙膜放在2 倍SSC 中浸泡
20 分钟,间断性摇动,然后取出放在一张干净的滤纸上,置60℃烘箱中烘30 分钟,使DNA
固定于尼龙膜上。
(11)将烤干的膜夹在两张干燥滤纸之间,置于室温下保存待用。
2.3.6 探针的标记
(1)将80ng 探针DNA(体积<30μl)倒进一个新的0.5ml 离心管中,在沸水中煮5~10
分钟,取出,插入碎冰中。
(2)然后依次在试管中加入下列成分:10μl 5 倍标记缓冲液(含随机引物),2μl BSA
(10mg/ml),2μl dATP、dGTP、dTTP 等量混合物(浓度为各 20μmol/dm3);30μl 灭菌蒸馏
水,50μl(α-32P)dCTP(10μCi/μl,3 000Ci/mmol)(至浓度为 333nmol/dm3);lμl Klenow
酶(3u/μl);最后体积为 50μl。
(3)将全部试剂混匀后置37℃保温壶中保温6 小时。
(4)加入等体积(50μl)的标记反应终止液终止反应。
2.3.7 未掺入核苷酸前体的除去
(1)取一0.5ml 离心管,在管底部打一小孔,用玻璃棉塞住小孔,外套一个1.5ml 离心
管。
(2)向0.5ml 的管中加满TE 饱和的Sephadex G-50。
(3)3 000r/min 离心 5 秒钟,重新加满Sephadex G-50 后再离心,直到 Sephadex G-50
加满0.5ml 小管的3/4。
(4)将标记反应液加入 0.5ml 管中,3 000r/min 离心数秒钟。
(5)将1.5ml 管中的液体(蓝色)移入另一1.5ml 离心管中。
(6)向0.5ml 管中加入 40μl TE,3 000r/min 离心数秒钟。
(7)重复(5)、(6)步骤2~3 次,直到凝胶中的紫色即将到达0.5ml 管底部。
(8)将回收的探针置于4℃下待用。
2.3.8 探针放射性强度的测定
(1)取两个液闪瓶,各加2ml 闪烁液。
(2)在其中一个液闪瓶内加入2μl 原标记反应液。
(3)在另一个液闪瓶内加人2μl 去除了未掺入核苷酸的回收液。
(4)将2 个液闪瓶置于液闪仪中,测定其cpm。
2.3.9 Southern 杂交
(1)将 25ml 杂交液放入方形塑料盒中,于 55℃下预热。
(2)将待杂交的膜和杂交液一起放入水浴摇床中。
(3)在55℃下预杂交1.5 小时左右。
(4)将放射性探针放在沸水中5 分钟,取出后迅速插入冰水中。
(5)在杂交液中按5×105cpm/ml 的浓度加入变性的探针。
(6)在55℃下杂交约15 小时。
(7)将杂交液中的膜取出,放入1 倍SSC 溶液中于55℃下漂洗10 分钟。
(8)倒去1 倍SSC 溶液,在55℃下用1 倍SSC 溶液及0.1 %SDS 洗脱液漂洗40 分钟。
(9)倒去洗脱液,55℃下用新的1 倍SSC 溶液及0.l%SDS 洗脱液漂洗30 分钟。
(10)将膜放入1 倍SSC 溶液中,于室温下漂洗10 分钟。
(11)取出膜,平摊在洁净、干燥的滤纸上。
(12)当膜上无水珠、膜仍湿润时,用保鲜膜将膜包好准备压片。
2.3.10 放射自显影
(1)在暗室或微弱安全光条件下,打开X 光曝光暗盒。
(2)放入一张增感屏,光滑面朝上。
(3)将膜放在增感屏上(膜与膜之间不能重叠)。
(4)置X 光胶片于膜上。
(5)将另一张增感屏光滑面朝下放在X 光胶片上。
(6)盖紧X 光暗盒,置—70℃冰箱内曝光1~7 天。
2.3.11 X 光胶片的冲洗
(1)显影:将X 光胶片从暗盒中取出,放入显影液中,间断性摇动数分钟。
(2)停显影:将X 光胶片放入1.5%的冰醋酸溶液中漂洗数秒钟。
(3)定影:将X 光胶片转入定影液中定影数分钟。
(4)冲洗:将定影完毕的X 光胶片放在流水中冲洗20 分钟,然后晾干。
2.3.12 放射性探针的除去
(1)将300~500ml 蒸馏水煮沸。
(2)往蒸馏水中加SDS,至最终浓度0.l%。
(3)将放射自显影后的膜浸入其中。
(4)待冷却至室温时将膜取出、烘干,即可用于另一种探针的杂交。向左转|向右转
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将反应所需的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减(在一秒钟内)的黄绿色闪光(发射峰560 nm),这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪(Luminometer)进行检测,也可用标准的液闪仪对光信号进行记录。当底物过量时,发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比,因此,可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计。荧光素酶易被蛋白酶降解,在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3 小时。荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法。
荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。
通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方,构建成报告基因质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。展开
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2. 检查流程:
(1) 检查时先让患者口服一粒碳14尿素胶囊。
(2) 静坐25分钟后,受试者直接向集气瓶内呼气,患者呼气后集气瓶中的液体由粉红色变成无色为止,或者患者持续呼气时间已经达到3分钟后即可停止呼气。
(3) 向集气瓶中加入4.5ml稀释闪烁液后,加盖旋紧,置于液闪仪中进行检测。
(4) 检查过程中患者应当保持安静,剧烈运动后血中的酸碱度变化可能影响同位素标记CO2的呼出,另外在患者呼气时应当嘱咐患者注意不要将集气瓶中的液体误吸入口腔。向左转|向右转
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