一、可溶性酵母蛋白的酶解

1.将1mg冷冻干燥的可溶性酵母蛋白加入0.5ml的变性溶液中，37°C溶解15min。

2.加入IAA至终浓度为50mmol/L，然后将样品置于暗处30mm，室温条件下使半胱氨酸残基烷基化。

3.样品透析：将样品溶液在100ml的透析液中室温透析lh，以除去盐和低分子量物质。

4.更换透析液，重复步骤③两次。

5.向样品中加人20ug胰酶，37°C孵育lOmin。

6.用10mmol/LTris-Cl(pH8.5)将样品稀释2倍（至1.Oml)，加入CaCl2至终浓度为1mmol/L。用pH试纸验证pH值是否在8到9之间。

若变性液中含SDS(步骤①），则必须使其在样品液中的终浓度低于0.1%，以便胰酶有效消化。

7.37°C条件下胰酶消化过夜。

8.用2ul的TFA酸化样品以终止消化，用pH试纸确证溶液pH值低于3。

也可用其他方法来溶解（步骤①）和消化蛋白质（例如可不加SDS，使用其他还原剂，若盐浓度很低则不用透析等）。不过在用SCX色谱进行多肽分离前，盐终浓度一定要低于20mmol/L(包括Tris-HCl和蛋白质水解产生的盐），且上样前需确保溶液的pH<3。若盐浓度高于20_〇1/L，可用膜透析（见步骤③和④），或依制造商提供的指导用Ql8固相抽提（SPE)柱（Vydac)除盐。

二、SCX色谱柱的准备

9.以SCX缓冲液和SCX色谱柱为基础建立HPLC系统。

10.设置柱流速为200ul/min，获得空白梯度。

用于多肽洗脱的缓冲液B在约5%~35%的区间应采取平缓梯度（见表8.12)，这样可使净电荷为+2的多肽片段（为胰酶酶解的主要产物）比线性梯度洗脱有更好的分离效果。

11.检测SCX柱的性能

（1）将溶于缓冲液A中的200pmol多肽标准品加至SCX柱上。

（2）用UV检测仪检测多肽在214nm的吸收。

应能获得6个完全分离的且峰宽小于1min的洗脱峰。

三、SCX色谱分离酵母肽混合物

12.将酸化的（pH<3)的酵母酶解多肽样品加到柱上，用缓冲液A洗柱5~10min，直至UV检测峰返回基线。

13.开始梯度洗脱，每分钟收集200ul洗脱组分。

图8.44所示为利用该技术分离Img酵母蛋白的洗脱图谱。该技术可以分离多达5mg的多肽，可根据样品量选用更大或更小的柱子。

14通过离心蒸发浓缩样品体积至50~100ul。

四、SCX色谱分离组分的RPC层析

将纳升级的反相色谱毛细管LC串联离子阱质谱仪，进行在线检测，其灵敏度最大，可鉴定的多肽最多。串联后，多肽的检测水平可达1~5fmol，并且串联质谱的获取速度达2000个图谱/h。

15.将一支内径75um、长20cm的桂化毛细管拉成针尖。

有很多方法可用于拉制电喷雾的细针。最简单的方法是将一重物（用胶带纸）粘在针上，然后用微火焰将毛细管拉尖。另外，在方案5中介绍的激光拉针器也很有效。不过，拉好的针或预装柱也可以买到（例如，NewObjective，Cambridge，Massachusetts)。

16.取一根已拉尖的75um的硅化毛细管，其中填充5um、200A的C18颗粒，柱床长度12cm(填充毛细管的方法详见方案4或方案5)。

毛细管的针尖不仅可以填料，而且还可充当MS的电喷雾针。

17.按照下列步骤连接微型四通的4个臂：

(1)来自HPLC的流动相（lOOjul/min);

(2)用于分流（50ym内径X50cm)的限流毛细管；流速99.7ul/min;

(3)一根连接到高压电源（1.8kV)的金导线；

(4)拉尖的纳升级反相毛细管柱（步骤?），流速为300nl/min。

18.将HPLC的流速调至100u1/min，利用微型四通进行分流，使流向反相层析柱的流速为300nl/min。

19.取经SCX色谱分离的组分50ul,离线加压上样（pressure-loadoff-line)，每次加样10ul或更多，然后进行梯度洗脱。

20.向ESI提交洗脱峰并在离子阱质谱中分析。

MS以两种模式运行，即MS模式（测定多肽离子的m/z)和MS/MS模式（多肽测序）。

在短短的1h的反相LC-MS/MS分析中，数据依赖型的MS/MS扫描可进行上千次肽段测序，将从MS扫描中所选择测序的多肽设定为「onthefly」，从每个MS图谱中选择5个肽段进行测序（裂解）。