Tissuelyser48利用CTAB法在多样品组织研磨机上提取植物总DNA
一、实验试剂：
1.CTAB抽提液：
2%（w/v）CTAB
100mmol/LTris-HCl(pH8.0)
20mmol/LEDTA(pH8.0)
1.4mol/LNaCl
抽提含多酚较多的植物材料时（比如木本植物），上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。
抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入约2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。
2、醋酸钠：
3mol/LNaAc
用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。
3、TE溶液：
4、其它：
无水乙醇，异丙醇，75％乙醇，酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），氯仿：异戊醇（24：1），β-巯基乙醇，重蒸水。
二、实验步骤
1.样品研磨
1)取1g的样品放入2mlepp管中
2)加入1-2粒5mm研磨珠
3)加入1ml的CTAB抽提液
4)将加有样品的epp管放入多组织研磨仪的适配器中，盖好
5)将研磨频率调到60Hz，设定研磨时间为90秒（可根椐样品的研磨的难易程度来调节，此数据是以银杏落叶为样本得出）
6)启动研磨仪对样品进行研磨（根据不同的样品，本身性质不同，需要对研磨频率和研磨时间进行适当的调整）
2.DNA的粗提
1)将研磨好的样品取出于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀
2)冷却后加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min
3)7000g-8000g离心10min（18-20℃）
4)吸取上清于另一干净的离心管中
5)（根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次，吸取上清）
6)加入与上清液等体积（且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，约1至2分钟后应有白色絮状沉淀出现（若没有，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3MNaAc,混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min）
7)离心法沉淀DNA
8)在75%乙醇中漂洗DNA数分钟以上，用Tip头吸干乙醇
9)用1ml75%乙醇再漂洗一次
10)沉淀于室温或64℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥
11)用50μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。
3.DNA的纯化
1)向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μlRNaseA(约40-100μg)
2)于37℃酶解RNA1hr或65℃酶解RNA30min以上
3)加入50μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻颠倒混匀10min
4)10000g以上常温离心10min，吸取上清
5)加入50μl仿氯：异戊醇（24：1）轻轻颠倒10min
6)10000g以上常温离心10min，吸取上清(根据需要可重复用氯仿：异戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚)
7)向上清中加入1/5-1/10体积的pH4.8-5.2的3MNaAc,并加入2.5倍体积无水乙醇，于－20℃沉淀30min以上
8)12000g、4℃低温离心10min,吸干液体
9)沉淀用75％乙醇漂洗二次
10)沉淀于室温或64℃以下恒温箱中干燥片刻至刚开始出现半透明状，勿过度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶
11)取5μlDNA电泳检查DNA的质量
12)100-500倍稀释后于分光光度计上测定OD260及OD280，分析DNA的浓度和质量
13)保存DNA于-20℃
补充：如果需要提取的样品比较多（比如1g），研磨好的样品在后续的提取中，需要转移到大的epp管中，研磨时可以加入较少的抽提液，研磨完毕按照1g样品10ml提取液补充抽提液，进行后续的操作。
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发布于 ： 2021-07-17
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