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claybird
用户
我检索了，很多有关丙酮沉淀的，可是没有找到如何能溶解。战友们，快帮忙啊！偶都溶了一个中午了，现在也没有溶解！！
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zxw_7854
用户用裂解液也溶不掉?
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claybird
用户是啊！我用丙酮沉淀，－20过夜后，离心，再用丙酮洗了两遍，洗的时候就觉得沉淀很难吹打开，洗完后我就将EP管开着盖放－20冰箱，第二天发现冻干了，白色粉末状，将其用1×SDS上样缓冲液溶，我个人觉得一点也没有溶，我敲打了一个中午，最后将EP管放在沸水里放了5分钟，感觉好像溶了一点点，就凑合着上样了，电泳的结果是，什么带也没有！快帮忙啊！
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zxw_7854
用户啊?你就直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?当然很难溶解.而且蛋白的浓度也很高.蛋白溶解需要高浓度的尿素.你可以将冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解,然后再加1×SDS上样缓冲溶液,再上样.
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claybird
用户尿素？裂解液裂解？可是1×SDS上样缓冲溶液不也可以当裂解液使用吗？一些实验室的裂解液就是1×SDS上样缓冲溶液，什么时候加尿素呢？？
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zxw_7854
用户可是你的蛋白很难溶解啊你用裂解液试试,应该没问题
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claybird
用户用裂解液溶解后是不是应该加2×或2×以上的上样buffer啊？
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华辰多肽
用户可以放在超声波清洗机超声一会，不过注意会变性的奥
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michael11
用户claybird 我检索了，很多有关丙酮沉淀的，可是没有找到如何能溶解。战友们，快帮忙啊！偶都溶了一个中午了，现在也没有溶解！！这是老问题。我也困扰了好久。没发现园子里有好的解决办法。加很猛的裂解液只能溶解一部分的。超声倒没试过。
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claybird
用户华辰多肽 可以放在超声波清洗机超声一会，不过注意会变性的奥偶知道细胞超声仪不会使蛋白变性，用这超超行不行？
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kiwi
用户超声我用过几次，还行，不影响最终结果，但要控制温度
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claybird
用户怎么个控制法？室温操作不行？
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zyh218
用户一般采用冰浴的方法，先冰浴预冷，然后边冰浴边超声。加尿素可能是一较好的办法，可助溶，同时对SDS-PAGE电泳结果没什么影响。可先用含8M尿素的Buffer悬浮沉淀，超声混匀，再加2Xloading buffer。另外注意一下pH值，使其尽量远离蛋白的PI值，个人认为在碱性的条件下溶解比较好，大多数蛋白在pH高达12时都比较稳定。
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claybird
用户8M尿素的Buffer？用怎样的buffer？1×SDS还是裂解液？
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zyh218
用户选用何种Buffer，取决于具体蛋白的情况，一般Buffer的pH值离蛋白PI值越远，蛋白在该Buffer中的溶解越好。常用的Buffer有PB、Tris-Cl、碳酸盐缓冲液等，含8M尿素的Buffer，即将8M尿素溶解在上述Buffer中。根据蛋白样品量，调整加入的Buffer量。将样本用含尿素的Buffer悬浮后，再用2X上样缓冲液处理样本。
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ziliand
用户展开引用claybird 是啊！我用丙酮沉淀，－20过夜后，离心，再用丙酮洗了两遍，洗的时候就觉得沉淀很难吹打开，洗完后我就将EP管开着盖放－20冰箱，第二天发现冻干了，白色粉末状，将其用1×SDS上样缓冲液溶，我个人觉得一点也没有溶，我敲打了一个中午，最后将EP管放在沸水里放了5分钟，感觉好像溶了一点点，就凑合着上样了，电泳的结果是，什么带也没有！快帮忙啊！......我的操作比你的简单很多，就是丙酮沉淀过夜，4度，12000rpm离心30min，倒掉丙酮，直接在室温下让丙酮自然挥发干（反正拿来做SDS）。然后普通的1*SDS上样buffer溶解，用枪头混就可以了，觉得不放心可以用震荡器稍微混一下，然后放沸水煮3-5min就好了。没有碰到那么难溶解的情况啊。
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claybird
用户zyh218 选用何种Buffer，取决于具体蛋白的情况，一般Buffer的pH值离蛋白PI值越远，蛋白在该Buffer中的溶解越好。常用的Buffer有PB、Tris-Cl、碳酸盐缓冲液等，含8M尿素的Buffer，即将8M尿素溶解在上述Buffer中。根据蛋白样品量，调整加入的Buffer量。将样本用含尿素的Buffer悬浮后，再用2X上样缓冲液处理样本。谢谢zyh218 战友！你能告知这些的buffer的配方吗？
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zyh218
用户大多数分子生物学及细胞培养方面的书籍的附录中都有常用缓冲液的配方，一定能查到的。
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claybird
用户偶觉得是不是因为蛋白冻干了，所以比较难溶啊？可不可以这样啊：丙酮－20过夜后离心，待丙酮挥发完后加2×SDS上样buffer溶解，如果溶的好，就立即99度3分钟变性，完了之后再放－20保存。如果溶的不好，就加入等体积的裂解液，再进行后面的步骤，不知这样可行不？
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zyh218
用户我认为可以。注意蛋白浓度不要过高，根据沉淀多少决定加入的Loading Buffer 的量。建议最终蛋白浓度为10~20 ug/10~20ul。
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claybird
用户为什么不能太高啊？怕不溶？还是浓度太高结果不好？如果是10~20 ug/10~20ul，上样量20ul的话，是不是太少了？我的蛋白不用浓缩也远远超过这个浓度了。
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zyh218
用户浓度高了可能对溶解有影响，并不是浓度高了不好。如果你的蛋白浓度能达到10~20 ug/10~20ul，应该不需要浓缩了。在这个浓度下，上样20ul就有20ug左右的蛋白了，这对考染已经足够了（考染的灵敏度可达到0.1 ug）。不过具体上样多少，还应根据你的实验需要来确定。
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claybird
用户考染的目的只是看看目的蛋白在什么位置，我们的目的是WB能出较好的带，偶的蛋白浓度是70－80微克/微升，是用紫外法测的，根据公式计算，不很准，但偶没有能直接测蛋白浓度的仪器，也只好如此了。偶觉得偶的蛋白裂解的还不错，浓度也不是很低，就是上样量太少了，所以WB的带老是太弱。
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claybird
用户zxw_7854 啊?你就直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?当然很难溶解.而且蛋白的浓度也很高.蛋白溶解需要高浓度的尿素.你可以将冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解,然后再加1×SDS上样缓冲溶液,再上样.我的裂解液种含有0.2M的盐酸，如果用冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解，就混入了盐离子，对结果会不会有影响？
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