protocol如下:
灌注取脑后,4%多聚甲醛4℃固定24-48h。修块3-4mm。
脱水(常温):45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%酒精各30min;
透明(常温):(100%酒精+二甲苯)/210min,二甲苯①20min,二甲苯②至完全透明(约20min)
浸蜡(60℃):(二甲苯+石蜡①)/210min,石蜡①30min,石蜡②40min;石蜡①为低熔点,石蜡②为高熔点
包埋:浸蜡后用石蜡②手动包埋;
切片厚度:6um、(8um也切的有)
展片:40℃水中展片;
烤片:60摄氏度烤片机侧烤约5min后吸去水分,转移至60℃温箱烤约4h;
脱蜡:烤片后趁蜡未凝固,进行脱蜡。二甲苯5min×2,100%酒精3min,95%酒精2min,
85%酒精2min,75%酒精2min,流水冲洗2min(放在缸子里用水泡的,换了几次水);
染色:
HE染色:苏木精5-8min(新配为5min,时间长可为8min,用前过滤),流水冲洗3min
1%盐酸酒精分化5s,流水冲洗1min,0.1%伊红1-2min,
脱水:85%酒精2min,95%酒精2min,100%酒精2min,
100%无水乙醇:二甲苯(1:1)2min
透明:二甲苯(I)3min,二甲苯(II)3min;
CV染色:浸入CV染液中10-20min,
脱水:75%乙醇2min,85%乙醇2min,95%乙醇2min,100%无水乙醇2min,
100%无水乙醇:二甲苯(1:1)2min
透明:二甲苯(I)3min,二甲苯(II)3min;
封片:中性树胶封片(整个染色过程避免干片)。
部分HE染色、CV染色片子结果如图所示,基本上没有完整的片子(染色时,片子随着在液体里的时间脱片、烂片的程度加深),另CV染色着色浅。
请教战友是什么原因?哪里出了问题,该怎么解决?
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