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求助!小鼠脑组织石蜡切片染色脱片
2016-05-31
问题描述:

protocol如下:

灌注取脑后,4%多聚甲醛4℃固定24-48h。修块3-4mm。

脱水(常温):45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%酒精各30min;

透明(常温):(100%酒精+二甲苯)/210min,二甲苯①20min,二甲苯②至完全透明(约20min)

浸蜡(60℃):(二甲苯+石蜡①)/210min,石蜡①30min,石蜡②40min;石蜡①为低熔点,石蜡②为高熔点

包埋:浸蜡后用石蜡②手动包埋;

切片厚度:6um、(8um也切的有)

展片:40℃水中展片;

烤片:60摄氏度烤片机侧烤约5min后吸去水分,转移至60℃温箱烤约4h;

脱蜡:烤片后趁蜡未凝固,进行脱蜡。二甲苯5min×2,100%酒精3min,95%酒精2min,

85%酒精2min,75%酒精2min,流水冲洗2min(放在缸子里用水泡的,换了几次水);

染色:

HE染色:苏木精5-8min(新配为5min,时间长可为8min,用前过滤),流水冲洗3min

1%盐酸酒精分化5s,流水冲洗1min,0.1%伊红1-2min,

脱水:85%酒精2min,95%酒精2min,100%酒精2min,

100%无水乙醇:二甲苯(1:1)2min

透明:二甲苯(I)3min,二甲苯(II)3min;

CV染色:浸入CV染液中10-20min,

脱水:75%乙醇2min,85%乙醇2min,95%乙醇2min,100%无水乙醇2min,

100%无水乙醇:二甲苯(1:1)2min

透明:二甲苯(I)3min,二甲苯(II)3min;

封片:中性树胶封片(整个染色过程避免干片)。

部分HE染色、CV染色片子结果如图所示,基本上没有完整的片子(染色时,片子随着在液体里的时间脱片、烂片的程度加深),另CV染色着色浅。

请教战友是什么原因?哪里出了问题,该怎么解决?




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yan1091038778
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求助!先自己顶。
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Justin001
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脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够
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yan1091038778
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展开引用Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够......透明的时候大约50min能够完全透明,从酒精进入二甲苯的时候组织周围不起雾,没有白色的出现。
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yan1091038778
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展开引用Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够......求助老师,通常透明时间是多久?组织完全透明是已经透明过度了么?
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Justin001
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展开引用yan1091038778Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够求助老师,通常透明时间是多久?组织完......我用的脱水时间就是上面说的,透明我就用的二甲苯共45分钟(分两次),量要够。
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yan1091038778
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展开引用Justin001yan1091038778Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够求助老师,通常透明时间是多久?组织完我用的脱水时间就是上面说的,透明我就用的二甲苯共45分钟(分两次),量要够。......您做的是大鼠吗?我脱水时间是参照《实验病理学技术图鉴》这本书,您的脱水时间和上面大鼠的脱水时间差不多。透明时间书上面大鼠加起来是2h,小鼠是8min。您做好透明后组织是全通透的还是按照时间做完后就取出组织?我的脱片原因会不会是透明时间过久?
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Justin001
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展开引用yan1091038778Justin001yan1091038778Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够求助老师,通常透明时间是多久?组织完我用的脱水时间就是上面说的,透明我就用的二甲苯共45分钟(分两次),量要够。您做的是大鼠吗?我脱水时间是参照《实验病理学技术图鉴》这本书,您的脱水时间和上面大鼠的脱水时间差不多。透明时间书上面大鼠加起来是2h,小鼠是8min。您做好透明后组织是全通透的还是按照时间做完后就取出组织?我的脱片原因会不会是透明时间过久?......小鼠的脑脱水我用的这个时间。8分钟是完全没可能把小鼠脑的水脱干净的,水没脱好,二甲苯也就进不了组织,浸蜡的时候蜡也进不了组织,没有蜡支撑组织切片也就切不出来。透明的这个时间我是摸索了一段时间的,效果不错就确定的45分钟
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yan1091038778
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展开引用Justin001yan1091038778Justin001yan1091038778Justin001脱水的时间你是参考的文献还是自己摸索的?个人觉得脱水不够。我处理脑片脱水是70%过夜,80%,90%各两个小时,95%,100%各一个小时,切片厚度是5μm,没有脱过片。脱水时间够不够可以通过透明的程度来反应,组织透明效果不好的很大原因是脱水不够求助老师,通常透明时间是多久?组织完我用的脱水时间就是上面说的,透明我就用的二甲苯共45分钟(分两次),量要够。您做的是大鼠吗?我脱水时间是参照《实验病理学技术图鉴》这本书,您的脱水时间和上面大鼠的脱水时间差不多。透明时间书上面大鼠加起来是2h,小鼠是8min。您做好透明后组织是全通透的还是按照时间做完后就取出组织?我的脱片原因会不会是透明时间过久?小鼠的脑脱水我用的这个时间。8分钟是完全没可能把小鼠脑的水脱干净的,水没脱好,二甲苯也就进不了组织,浸蜡的时候蜡也进不了组织,没有蜡支撑组织切片也就切不出来。透明的这个时间我是摸索了一段时间的,效果不错就确定的45分钟......多谢老师指导,另外问老师两个关于细节方面的处理。一是固定好的组织要用流水冲洗很长一段时间吗(之前做是用pbs冲了一下)?二是烤片之后要冷却至室温再进行脱蜡吗(之前是从60℃烘箱拿出来装在染色架上后接着就脱蜡)?上面两个细节处理不好会是导致图上问题的原因吗
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Justin001
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yan1091038778
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Justin001
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yan1091038778
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Justin001
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一个阿泽
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我也出现了和楼组一样的情况,想请问楼主现在解决了吗?
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hehe201606
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前期没有处理好吧,
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水墨丹青冉冉
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楼主您好,我最近做小鼠的一半脑的石蜡切片,也遇到您一样的问题,脱片之后的图样都几乎相似。请问您的问题最后是怎么样解决的呢?期待您的恢复。
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