DNA的琼脂糖凝胶电泳实验一电泳法
实验方法原理 | 在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 | ||||||||
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实验材料 | 质粒DNABAC 试剂、试剂盒 | 琼脂糖溴酚蓝溴化乙锭 仪器、耗材 | 制胶板电泳槽紫外透射仪 实验步骤 | 1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上; 2. 调整好梳子的高度; 3. 称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50篊时倒入制胶板中; 4. 凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带; 5. 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中; pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5mltube中混合后点样; 6. 将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动; 7. 电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5礸/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。 注意事项 | 1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素: (1)DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA) (2)胶浓度,U为迁移率,U0t琼脂糖浓度:logU=logU0Kr为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率, (3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 (4)所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm (5)碱基组成与温度:一般影响不大4-30℃ (6)嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中) (7)电泳缓冲液(0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTApH8.0)。 2. 溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。 3. 电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylenecyanol,Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 |
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发布于 : 2021-08-17
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