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单向聚丙烯酰胺凝胶电泳实验一表观分子量的判定实验
来自 : 蚂蚁淘
实验材料
实验步骤

1.将目的蛋白和标准分子量蛋白上样到同一块SDS-PAGE平板凝胶中,按照方案1的步骤进行SDS-PAGE。

在同一块平板凝胶上进行目的蛋白和标准分子量蛋白的电泳,可以消除由于丙烯酰胺浓度和电泳条件不同而产生的差异。可以通过商业途径获得多种标准蛋白试剂盒,标准蛋白及其分子量的详细资料也可在Weber和Osborn(1969)、Neville(1971)以及Hames(1990)中找到。若要用此方法更精细地测定分子量,最好能采用不同浓度的丙烯酰胺凝胶(Ferguson,1964;Neville,1971)。关于在使用多种市售标准蛋白进行SDS-PAGE时,聚丙烯酰胺和交联剂两者浓度对蛋白迁移的影响,在Makowski和Ramsby(1997)中有详细讨论。

2.电泳结束后,进行蛋白染色(方案2?~7)。

3.(可选或不选)在测量尺F值之前干燥凝胶。

4.测量蛋白和示踪染料(通常是溴酚蓝)迁移的距离。

5.计算相对迁移率(Rf值):

RF=蛋白迁移的距离/示踪染料迁移的距离

6.用迁移率对已知Mr的半对数作图。凝胶中部各点应几乎在一直线上(见图2.7)。

7.通过未知蛋白的RF值从曲线图上读出未知蛋白的Mr。

要点:每块胶应重新绘制标准曲线。

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