| 实验方法原理 | 在第一向IEF和IPG胶条平衡之后，需进行第二向SDS-PAGE。SDS-PAGE是基于蛋白质分子量的不同而将其分离的。这种分离系统可从多家供应商处获得，在许多蛋白质化学实验室中也普遍使用。这里介绍放置IPG胶条的方法以及第二向凝胶电泳条件。 | ||||||
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| 实验材料 | 已聚焦IPG胶条 试剂、试剂盒 | 琼脂糖密封溶液蛋白质分子量标准5XSDS电泳缓冲液 仪器、耗材 | 滤纸钳子和多用尺子温度控制仪电源SDS-PAGE凝胶垂直电泳设备 实验步骤 | 1.在100°C加热琼脂糖封闭溶液使之熔化。每块凝胶约需1ml溶液。完全熔化琼脂糖要花1Omin，最好在即将平衡IPG胶条时进行（方案8)。琼脂糖熔化后，将其冷却至40~50°C。 2.在第二向凝胶表面的平板之间用钳子定位平衡后的IPG凝胶条，保证塑料支持条靠着其中一块玻璃平板。在平板之间用一把薄的软塑料尺子推动IPG胶条，直到IPG底边和凝胶表面紧密接触。从IPG胶条一端至另一端逐渐沿玻璃平板推动胶条。为了避免IPG胶条被撕破，应在凝胶的塑料支持面施力使IPG胶条放入适当位置。 保证在平板凝胶和IPG胶条底边之间，以及塑料支持和玻璃平板之间没有气泡。如果有气泡，轻压IPG胶条的塑料支持赶走气泡。如果气泡在第二.向凝胶上方，不要过重地压IPG胶条表面，那样可能会使SDS-PAGE凝胶上表面的孔径缩小。 3.如果需要分子量标准，将准确剂量的分子量标准（对考马斯染色来说需200~1OOOng;对银染来说，需10~50ng)和已熔化的琼脂糖封闭溶液混合，吸取15~20ul此混合物至一小张滤纸上。 4.琼脂糖凝固后，将滤纸夹在两个玻璃平板之间，以便它在IPG胶条末端和平板凝胶上部相连接。 如果凝胶将用于印迹，用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶或抗生物素蛋白-碱性磷酸酶作蛋白质检测，可使用生物素酰化标准。所使用的生物素酰化标准量见操作指导手册。 5.缓慢吸取溶化的琼脂糖封闭溶液至IPG胶条上，避免产生气泡。在继续下述步骤之前，琼脂糖应冷却并凝固至少lmin。 在琼脂糖内包埋凝胶条是为了固定胶条使之处于正确位置，确保IPG胶条和凝胶之间的良好连接。 6.按操作指导手册，完成电泳装置的安装。连接冷却装置（如果有的话），使其保持凝胶温度在10~15°C。 虽然冷却不是必需的，但这样可大大减少凝胶之间的变化，并允许凝胶在高电流下电泳，这样可减少电泳的时间。 建议标准和大型凝胶应冷却，冷却可大大提高凝胶之间的重复性，有助于减少人为的影响，例如凝胶的「微笑，，条带。如果在实验室中温度有大的波动，冷却就非常重要了。 7.按方案中表7或表4.8中建议的电泳条件来设置电泳仪，打开电源，开始电泳。 电泳分两步进行。第一步持续时间较短，使用低电流或低功率设置，使蛋白产生最初的迁移和堆积，在电泳开始5~15min之后（见表4.7和表4.8)，检查溴酚蓝是否已进人凝胶；第二步，电流或功率要升高以允许快速分离。 8.当溴酚蓝达到距凝胶底部0.5~1cm时，关掉电源，从电泳槽中将凝胶移出。 9.将凝胶水平放置，除去隔板，小心不要损坏凝胶，用塑料弹性刀片小心将每块凝胶的两块玻璃平板分开。不要用金属切片，因其会在玻璃板上留下划痕。凝胶应该贴于其中一面玻璃板。 10.立即进行凝胶的染色（方案10~方案14)或蛋白质的转膜（方案15~16。
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