电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验一方案3 蛋白质还原和S羧甲基化：微量方法
| 实验材料 | 纯化的蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 乙腈碘乙酸正丙醇还原缓冲液储存液 仪器、耗材 | 台式离心机HPLC系统冷冻干燥离心机聚丙烯小管水浴或温箱 实验步骤 | 一、样品还原1.利用冷冻干燥离心机蒸发纯化的蛋白质样品溶液（含0.01%~0.02%Tween-20)，直到少于10ul。 2.加入150ul储存液到含有近乎干燥的蛋白质样品的离心管中，轻轻弹击或振荡离心管，使样品彻底混匀，然后略微离心样品。 3.加人16ul还原缓冲液，使DTT的终浓度为15mmol/L。 4.样品在40°C孵育4.5~5h。 二、样品烷基化5.还原过的蛋白质样品溶液置于室温。 6.加入20ul0.5mol/L碘乙酸，至碘乙酸的终浓度为0.05mol/L。 7.25°C避光反应30min。 三、S-羧甲基化蛋白质的回收（脱盐和浓缩）8.将2%~3%(约300ng蛋白质）的总混合物上样到反相微孔层析柱中（50mmX1mm内径HPLC系统）。 在加人大量的蛋白质至RP-HPLC之前，用2%~3%的总样品（约300ng)做预实验，以确定样品能够从反相柱上回收。这个脱盐的预实验极为重要，因为一些蛋白质在S-羧甲基化后会有不同的层析结果（比如，它们比天然的蛋白质更加疏水）。如果S-羧甲基化蛋白的疏水性比天然蛋白质的疏水性高得多，用TFA/乙腈溶剂系统就很难从反相柱上回收蛋白质。这时可试用正丙醇代替乙腈，如果仍不行，试着用微尺寸排阻层析或快速微型脱盐系统对S-羧甲基化蛋白进行脱盐。 9.一旦确定S-竣甲基化蛋白质能够从反相柱上回收，即可加人剩余的蛋白质样品。 10.至于Tween-20调节含有S-竣甲基化蛋白的部分（一般在300~500ul0.1%TFA水溶液/乙腈中），至终浓度为0.2g/L。关于收集到的S-羧甲基化蛋白的酶解消化，见方案5。 |
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发布于 ： 2018-08-05
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