实验材料 | 冻干的目标蛋白质 试剂、试剂盒 | CaCl2NH4HCO3苯甲基磺酰氟(PMSF)胰酶贮存液Tween-20 仪器、耗材 | 聚丙烯试管水浴箱 实验步骤 | 1.冻干的蛋白质底物溶解在1%的碳酸氢铵中,控制使用尽量少的溶液体积,以达到较高的底物浓度。 当蛋白质底物很微量(如小于1mg)时,加入Tween-20到碳酸氢铵中使其终浓度为lg/L,否则底物(和酶)会吸附在管壁上,造成样品损失。碳酸氢铵是一种易挥发的缓冲溶液,通过冷冻干燥轻松去除。PH8的不易挥发的缓冲溶液,例如0.05mol/LTris-HCl(pH8.0~8.3)可以代替碳酸氢铵。 2.将胰酶加到底物中去。对于变性的蛋白质(比如还原或烷基化的蛋白质),底物与酶的比例为200:1到50:1;对于天然蛋白质,比例可以高达1:1;对于凝胶中的蛋白质消化,不管底物的量是多少,用0.5~1.Oug的胰酶(一般而言,对于考马斯亮蓝染色的蛋白质用量小于0.5ug)。 3.设无蛋白质样品的对照反应混合物(如果样品充足,可设不加胰酶的第二份反应液),作为RP-HPLC肽段作图的对照。 4.反应液置于37°C保持16h(也可过夜) 5.把样品转移到RP-HPLC层析柱上以停止反应,并开始肽谱分析,或把反应液放到冰上以减慢反应。 或者加入特异性的抑制剂以终止反应。抑制剂如N-α-甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(N-α-tosyl-L-lysylchloromethylketone),或N-甲苯磺酰-L-丙氨酰氣甲酮(N-tosyl-L-pHenylalaninechloromethylketone;TPCK),或PMSF,加人量要多于所用的胰酶量。因为胰酶在低pH值的情况下活性不高,也可以通过调节反应混合物的pH值为2~3来终止反应(比如加人易挥发的乙酸或三氟乙酸)。 |
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