血清蛋白醋酸纤维素膜电泳检测试验
实验方法原理 | 带电质在电场中向与其极性相反的方向流动的现象称为电泳.血清中各蛋白质都有不同的等电点,当将其置于比其等电点高的PH缓冲液中时,他们都将带负电荷在电场中向正极泳动.由于各蛋白质等电点及所带电荷量和分子量大小都有所不同,因而在电场中泳动速度不同,利用这个特点将血清中各种蛋白质分开. | ||||||
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实验材料 | 醋酸纤维素膜 仪器、耗材 | 电泳仪电泳槽血清加样带分光光度计滤纸剪刀
实验步骤 | 实验仪器:电泳仪电泳槽血清加样带分光光度计滤纸剪刀 实验材料:醋酸纤维素膜规格2×8cm。 实验试剂: l.巴比妥-巴比妥钠缓冲液(PH8.6+0.1.离子强度0.06):称取巴比妥2.21g,巴比妥钠12.369于500ml蒸馏水中,加热溶解,待冷至室温后,再用蒸馏水补充至于1L。 2.氨基黑10B染色液:称取氨基10B0.1g,溶于无水乙醇20ml中,使溶解。另取磺基水杨酸2.5g,溶于74.5ml蒸馏水中,再将二液混合摇匀。 3.漂洗液:甲醇45ml,冰醋酸5ml和蒸馏水50ml,摇匀. 4.0.4M氢氧化钠溶液。 实验操作: 1.将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其在同一水平面上。 2.醋纤膜的准备:取在缓冲液中浸泡的醋纤膜一张,在毛面的一端(负极侧)1.5厘米处,用铅笔画一横线,作点样标记,编号后,将醋纤膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,待充分浸透后取出(一般为二十分钟)夹于洁净滤纸中间,吸去多余的缓冲液。 3.将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽的支架上拉直,用微量吸管吸取无溶血血清在横线处沿横线加3-5微升。样品应与膜的边缘保持一定距离,以免电泳图谱中蛋白区带变形,待血清渗入膜后,反转醋纤膜,使光面上平直地贴于电泳槽的支架上,用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液连通,稍待片刻. 4.接通电源,注意醋纤膜上的正负极,切勿接错.电压90-150伏,电流0.4-0.6mA/cm宽(不同电泳仪所需电压.电流可能不同,应灵活掌握);夏季通电45分钟,冬季通电60分钟,待电泳区带展开约25-35mm。,即可关闭电源。 5.染色:通电完毕,取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中,染色5-10分钟(以白蛋白染透为止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景无色为止。 6.定量:将漂洗净的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管内,在白蛋白管内加0.4M氢氧化钠溶液6ml(计算时吸光度乘2),其余各加3ml,振摇数次,置37度水箱20分钟,使其染料浸出.对于浸出的氨基黑10B,用分光光度计,在波长600-620nm读取各管吸光度,然后计算各自的含量(在醋纤膜的无蛋白区带部分,剪一条与白蛋白区带同宽度的膜条,作为空白对照). 计算: 各组分蛋白%=Ax/At×100% 各组分蛋白g/L=各组分蛋白百分数×血清总蛋白g/L AX表各组分蛋白吸光度At表各组分蛋白吸光度总和 参考值: 注意事项 | 失败原因: 1.电泳图谱不整齐:点样不均,薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发,缓冲液变质:电泳时薄膜放置不正确,使电流方向不平行. 2.蛋白组分分离不佳:点样过多,电流过低,薄膜结构过分细密,透水性差,导电性差等. 3.染色后白蛋白中间着色浅:由于染色时间不足或染色液陈旧所致:若因蛋白含量高引起,可减少血清用量或延长染色时间,一般以延长2分钟为宜.若时间过长,球蛋白百分比上升,A/G值会下降. 4.薄膜透明不完全:温度未达到90度以上将标本放入烘箱,透明液陈旧和浸泡时间不足等。 5.透明液上有气泡:玻璃片上有油脂,使薄膜部分脱开或贴膜时滚动不佳. 免责声明 本文仅代表作者个人观点,与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
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发布于 : 2018-08-05
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