脉冲场凝胶电泳制备DNA（哺乳动物细胞和组织DNA的分离）
| 实验方法原理 | 本方案叙述了从培养细胞和组织制备DNA样品的方法。病人或动物来源的白细胞也能用作PFGE的高分子质量DNA样品。如果确有必要，DNA也可以从哺乳动物细胞分离出的胞核制备。经验表明：从胞核制备DNA没有优点，因为从完整细胞制备的DNA同样易于酶切。 | ||||||
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| 实验材料 | 细胞或组织样品 试剂、试剂盒 | EDTAL缓冲液磷酸缓冲盐液红细胞裂解缓冲液TE 仪器、耗材 | 低熔点琼脂糖SorvallSS-34或相当的转头纱布玻璃匀浆器细胞计数板LeucoPrep细胞分离管研钵和研杵水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 EDTA(0.5mol/L,pH8.0) L缓冲液（0.1mol/LEDTA(pH8.0)，0.01mol/LTris-Cl（pH7.6)，0.02mol/LNaCl，4℃贮存） 含蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl)的L缓冲液 磷酸缓冲盐液（PBS) 红细胞裂解缓冲液（155mmol/LNH4CI，0.1mmol/LEDTA，12mmol/LNaHCO3，用此缓冲液分离白细胞） TE(pH7.6) 含40μg/mlPMSF的TEpH7.6 2.凝胶 低熔点琼脂糖（1%) 3.离心机和转头 SorvallSS-34或相当的转头 4.专用设备 纱布 带有紧配合杵头的玻璃匀浆器，冰中预冷。 细胞计数板 LeucoPrep细胞分离管（BectonDickinson) 研钵和研杵，预冷到-70℃ 42℃和50℃水浴 5.细胞和组织 细胞或组织样品 二、方法 1.制备细胞或组织样品。 (1)培养细胞 ①用冰冷的PBS洗生长中的培养细胞3次。 ②用无菌的橡胶制刮细胞器收集至一个小体积冰冷的PBS内。 ③以约2X107个细胞/ml的浓度在冰冷的L缓冲液中混悬细胞。 (2)新鲜组织样品 ①在培养皿内，用清洁的手术刀将新鲜组织切割成小块（1~2mm3)。用预冷的玻璃匀浆器在冰冷的PBS内匀浆。 ②经两层纱布过滤除去结缔组织碎片。 ③用冰冷的PBS洗混悬的细胞3次，再以约2X107个细胞/ml的浓度在冰冷的L缓冲液中混悬细胞。 用血球计数器计算细胞数。 (3)冰冻组织样品 ①用-70℃预冷的研钵将冰冻组织研成粉末，然后混悬在冰冷的PBS中。 ②经两层纱布过滤除去结缔组织碎片。 ③用冰冷的PBS洗混悬的细胞三次，再以约2X107个细胞/ml的浓度在冰冷的L缓冲液中混悬细胞。 (4)血液白细胞样品 ①用LeucoPrep细胞分离管经离心将5~10ml血液粗分出白细胞和红细胞。 ②加4倍体积的红细胞裂解液到淡黄色的白细胞层，顛倒2~3次轻轻混合。 ③在缓冲液中室温下温育5min，然后3000g(相当SorvallSS-34转头5000r/min）室温下离心5min。 ④在室温将沉淀用1mlPBS混悬。 2.用L缓冲液配制一体积1%低熔点琼脂糖，它相当于步骤1中细胞制备的体积。冷却熔化的琼脂糖到42℃。 3.琼脂糖降温至42℃时，温热细胞悬液（步骤1)到相同温度。混合熔化的琼脂糖和混悬的细胞。用封口的巴斯德吸管搅动混合物以保证细胞完全均匀分散到琼脂糖中。 4.吸出熔化的混合物移入预制的Plexiglas模具（50~100μl，PHarmacia或BioRad)，或将混合物吸至适当长度的Tygon管（内径1/8英寸或3.2mm)或1ml塑料注射器内。室温放置模具15min,然后移至4℃放置15~30min。 5.琼脂糖凝结后，从Plexiglas模具轻轻收集凝胶栓，或者从Tygon管或注射器管轻轻吹出凝胶栓，放在培养皿内。将圆柱状的凝胶栓切成长1cm的段。 6.将凝胶栓移入3倍体积的含0.1mg/ml蛋白酶K和1%(m/V)Sarkosyl的L缓冲液内。50℃温育3h。再用两倍体积新鲜的上述缓冲液替代用过的，继续50℃温育12~16h。 7.50倍体积TE(pH7.6)3h内安排3~5次换液，室温温育凝胶栓。 8.除去TE，用两倍体积含40μg/mlPMSF的TE(pH7.6）50℃温育30min。 9.用50倍体积TE(pH7.6)3h内安排3~5次换液，室温温育凝胶栓。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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