SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳一样品的准备
| 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺单体贮液磷酸缓冲液贮液咪唑缓冲液贮液过硫酸铵浓缩胶缓冲液贮液分离胶缓冲液贮液SDSTEMED 实验步骤 | 一、样品缓冲液的配制 根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3~4倍于蛋白的SDS和足以断裂二硫键的还原试剂（2%~3%二硫苏糖醇或4%~5%β-巯基乙醇)。由于巯基乙醇具有强挥发性，最好在配制样品前再将其加到样品缓冲液中。配制好的样品还必须在100℃水浴中保温3~5分钟（对一些样品可在37℃保温6小时)。在每克蛋白质断裂二硫键并结合1.4g单体SDS后，SDS-多肽胶束带负电，具有恒定的荷/质比。胶束的斯托克斯（Stokes)直径和分子质量成正比，通常在样品溶液中加1%到2%(W/V）SDS，在凝胶中加0.1%SDS。 连续电泳的样品缓冲液可根据缓冲系统选择如下： 1.磷酸缓冲系统的样品缓冲液（0.01mol/L,pH7.1) 0.2gSDS+1ml磷酸缓冲缓冲液（0.2mol/LpH7.1）+0.2mlβ-巯基乙醇+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml。4℃保存。 2.咪唑缓冲系统的样品缓冲液（0.01mol/L,pH7.0) 0.2gSDS+2ml咪唑缓冲液贮液（0.1mol/LpH7.0）+0.2mlβ-巯基乙醇+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml。4℃保存。 不连续电泳的样品缓冲液（0.08mol/LTris-HCl,pH6.8)通常用1.6ml浓缩胶缓冲贮液（1mol/LTris-HCl，pH6.8)+4ml10%SDS+0.3g二硫苏糖醇（或1mlβ-巯基乙醇）+2.5ml87%甘油+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml。4℃保存。如采用pH8.8Tris-HCl缓冲液或其他缓冲液会得到不同的分离结果。 小孔梯度SDS电泳样品缓冲液（0.15mol/LTris-HCl，1%SDS)的配制：0.2gSDS+2ml凝胶缓冲贮液（1.5mol/LTris-HCl，0.4%SDS，pH8.8)+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml，4℃保存。 二、蛋白标准的准备 选择合适分子质量范围的市售蛋白标准或自己配置一套蛋白标准（5~7种蛋白）溶解在样品缓冲液中，与样品一样在100℃煮3~5分钟，分装，在-20℃可保存6个月。但使用前还需再煮和加适量β-巯基乙醇（如果样品缓冲液中是用β-巯基乙醇作还原剂)。 三、样品浓度和加样要求 样品溶解后应分装。如短期保存，可放在4℃，如长期保存应放在-20℃。使用前还需再次在100℃煮3~5分钟，并加β-巯基乙醇（如样品缓冲液中原来用β-巯基乙醇作还原剂)。 样品浓度和加样要求同常规聚丙烯酰胺凝胶阳极电泳，请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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