1.储存液的配置

（1）2MTris-HCl（PH8.8），100ml

称取24.2gTris碱；加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；

加蒸馏水至100ml。

（2）1MTris-HCl（PH6.8），100ml

称取12.1gTris碱；

加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；

加蒸馏水至100ml。

（3）10％（w／v）SDS，100ml。室温保存

称取10g的SDS；

加蒸馏水至总量为100ml。

（4）50％（v／V）甘油，100ml

到取50ml100％的甘油；

加入50ml蒸馏水。

（5）1％（w／v）溴酚蓝，10ml

称取100mg溴酚蓝；

加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；

过滤除去聚合的染料。

2.工作液的配置

（1）A液：丙烯酰胺储存液，100ml

30％（w／v）丙烯酰胺，0.8％（w／v）双丙烯酰胺，

29.2g丙烯酰胺

0.8g双丙烯酰胺

3.灌制分离胶

（1）组装凝胶模具叫按照使用说明书，装配好灌胶用的模具。

对于Bio－Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触（见图1），钉细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。

图1Bio－Rad的Mini-Protean凝胶模具组装示意图

（2）将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺（A液中）是神经毒素，操作时必须戴手套。

（3）加入过硫酸铵和TEMKD后，轻轻搅拌使其混匀（过量气泡的产生会干扰聚合）。凝胶很快会聚合，操作要迅速。

（4）小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内（见图2），这样可以避免在凝胶内产生气泡。

图2用滴管将凝胶溶液加入凝胶模具

（5）当加入适量的分离胶溶液时（对于小凝胶，凝胶液加至约距的玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm，见图3）。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1～5mm的水层，这使凝胶表面变得平整。

图3分离胶聚合之前

（6）等待30～60min，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。另外的办法是将灌完分离胶后剩余的凝胶溶液置于一个小容器内，作为检测凝胶聚合的标志。如果凝胶渗漏，但还没有覆盖水层。可以回收分离胶溶液，重新装配玻璃板和隔片，在凝胶聚合之前重新灌胶。分离胶可在4℃储存一周。

4.灌制堆积胶

（1）吸尽覆盖在分离胶上的水；

（2）将A液、C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合；

（3）加入过硫酸铵和TEMED，并轻轻搅拌使其混勻；

（4）将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端（见图4）；

图4将堆积胶溶液用吸管加入凝胶模具

（5）将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐（见图5和图6）。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生；

图5将加样孔梳子插入堆积胶

图6堆积胶聚合之前

（6）约30min凝胶聚合；

（7）凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂；

（8）将凝胶放入电泳槽内，如果使用Bio-Rad的微型凝胶系统，可预先接好电极；

（9）将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

5.制备样品和上样

（1）每孔的上样量（Bio-Rad的微型凝胶系统）

（2）将蛋白质样品与5×样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合；

（3）100℃加热2～10min；

（4）离心1s，如果有大量蛋白质碎片则应延长离心时间；

（5）用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部。并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。

6.电泳

（1）将电极插头与适当的电极相接。电流应流向阳极；

（2）将电压调至200V（保持恒压；对于两块0.75mm的胶来说，电流开始时为100mA，在电泳结束时应为60mA；对于两块1.5mm的胶来说，开始时应为110mA，结束时应为80mA。）；

（3）对于两块0.75mm的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需30～40min（1.5mm的凝胶则需40～50min）；

（4）关闭电源；

（5）从电极上拔掉电极插头；

（6）从电泳槽中取出凝胶玻璃板；

（7）小心移动两玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。

7.考马斯亮蓝染色

（1）戴上手套避免将手指印留在电泳胶上，将胶移入一个小的盛有少量考考马斯亮蓝（20ml已经足够）的容器内（小心不要将胶撕破）、或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落；

（2）对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5～10min，对于1.5mm的凝胶，则需10～20min，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口；

（3）弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色；

（4）加入考马斯亮蓝脱色液（约50ml），清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲冼掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。

8.银染色

（1）戴上手套，将凝胶移至一个盛有50％中醛和10％醋酸混合液的小容器内，至少浸泡换液2～3次；

（2）用清水漂洗30min，期间至少换水3次；

（3）准备溶液A，B、C；

（4）将凝胶移入一个干净的容器内，在持续温和振摇下用C液染色15min；

（5）用去离子水漂洗凝胶，在轻轻振摇下浸泡2min；

（6）准备溶液D；

（7）将凝胶移至一个干净的容器内，用溶液D洗涤，显色。银染的电泳带一般在10min内出现，则更换溶液D。如果背景已开始变为淡黄色，则应该停止反成；

（8）将凝胶浸入1％的醋酸终止反应；

（9）在蒸馏水中漂洗凝胶至少1h，换水三次；

（10）如果蛋白质染色太深，则可用KodakRapidFix或KodakRapidUnfix使电泳胶脱色再用Kodakclearingagent（如Orbit）终止脱色，然后用50％甲醉/10％的酷酸漂洗；

（11）将凝胶保存于水中或进行干胶。

9.干胶

（1）将凝胶置于一个干净的表面上（玻璃板或洁净的操作台上）；

（2）用蒸馏水做润滑剂，调整加样孔间隔胶便其保持垂直；

（3）用一张10cm×12cm的Whatman3MM滤纸覆盖凝胶，将滤纸连同凝胶从玻璃板或操作台上揭下来，凝胶会粘在滤纸上；

（4）用一张玻璃纸或塑料保鲜膜覆盖在凝胶的表面，小心不要将气泡裹进去，这样会导致凝胶的破裂。可用一个试管作为卷轴拖运可以有效的除去气泡；

（5）将Whatman滤纸与凝胶置于干胶器上，开启加热和抽真空开关，并盖上带有密封圈的盖子。