放线菌素D诱导HL60细胞凋亡的观察实验一凝胶电泳法
| 实验方法原理 | |||||||||
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| 实验材料 | HL-60细胞 试剂、试剂盒 | 放线菌素D琼脂糖TAE异丙醇乙醇DNA提纯试剂盒DNAMarker溴化乙锭6×loADIngbuffer染液染液工作液甲醇PBS液 仪器、耗材 | 微量加样器枪头离心管三角烧瓶电泳仪电泳槽高速冷冻离心机水浴锅涡流振荡器微波炉紫外透射仪载玻片 实验步骤 | 一、细胞基因组DNA提取 1. 药物处理：取处于对数生长期的HL-60细胞（5×105个/ml）加入放线菌素D至终浓度5ug/ml，37℃孵育20小时。 2. 收集细胞：4℃，1500×g，离心5min，弃上清。 3. 清洗细胞：加入600ulPBS重悬细胞，1500×g，离心5min，弃上清。 4. 加入600ulNucleilysissolution，来回吸打数次。 5. 加入3ulRNAasesolution，颠倒离心管5次，混合样品。 6. 37℃，水浴30min，室温静置5min。 7. 加入200ulproteinprecipitationsolution，涡振20sec，置冰中5min。 8. 4℃，13000×g离心5min。小心吸上清于另一离心管中。 9. 向上清液中加入600ul异丙醇，颠倒混合。4℃，13000×g,离心5min。弃上清，收集沉淀DNA。 10. 加入600ul70％乙醇，颠倒数次，清洗DNA。4℃，13000×g,离心2min。小心弃上清，室温干燥沉淀10-15min。 11. 加入10ulDNArehydrationsolution，65℃，水浴30-60min，并定期轻柔振荡离心管使沉淀溶解。 12. 溶解液（即DNA提取样品）4℃保存备用。 二、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 1. 灌制琼脂糖凝胶 （1）备好注胶槽，插上梳子。称1g琼脂糖，加100mlTAE，微波炉加热溶解。 （2）向胶槽中注入温热的1％琼脂糖胶，胶层厚度约3-5mm。 （3）室温静置30-45min，使琼脂糖胶完全凝结。小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，使梳孔端靠近阴极（黑色）。 （4）向电泳槽中加入TAE，让液面刚好没过凝胶约1mm。 2. 加样，电泳 （1）在蜡膜上分别加3滴6×loadingbuffer，每滴2ul。 （2）从4℃冰箱中取出制备好的未经放线菌素D和经放线菌素D处理的DNA样品各10ul，加入到loadingbuffer中。在余下的一滴loading buffer中加5ulDNAmarker和5ul灭菌去离子水，反复吸打，充分混合。 （3）用加样器分别把上述样品缓慢加至琼脂糖凝胶的加样孔中。 （4）盖上电泳槽盖，接好电极插头，打开电源，电压调至100-110V，电泳45-60min。 （5）将电压调至零，关电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。 3. 染色观察 （1）取出凝胶，放入含有EB（0.5ug/ml）的溶液中，室温浸染20min。 （2）于暗室中，在紫外灯下进行观察。 （3）染色结果：经放线菌素D处理的细胞在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状DNA区带图谱（DNAladder），这是细胞凋亡的重要生化特征。而未经处理的细胞则没有DNA凋亡所特有的梯形条带。DNA断裂情况可与对照比较，断裂程度用DNAmarker所显条带度量。 三、凋亡细胞普通光镜下形态观察――Giemsa染色法 1. 收集凋亡细胞悬液于1.5ml离心管中，4℃，500rpm，离心5min。 2. 弃上清，将细胞重悬于PBS液中，制成细胞悬液。 3. 取100ml细胞悬液，涂于载玻片上，晾干。 4. 用甲醇固定1min,充分晾干。 5. 滴加Giemsa染液（工作液浓度），室温染色5min。 6. 用流水轻轻洗去染液，室温晾干。 7. 用二甲苯浸泡3min，去除杂质，待载片透明后，以树脂封片。 8. 普通纤维镜下观察。 9. 结果观察：Giemsa染色的标本，细胞核红紫色，细胞质蓝色，凋亡细胞的核染色质固缩边集，染色较深或核破裂；细胞膜皱褶、卷曲，或出泡芽生，形成凋亡小体。 四、凋亡细胞的荧光显微镜下形态观察 1. 培养细胞，诱导凋亡（在超净台进行）。 2. 收集细胞：1000g/min离心5min，其上清。 3. PBS（37℃）漂洗悬浮细胞。 4. 固定液（4℃）固定5min,500~1000g/min离心5min，弃上清。 5. 蒸馏水洗，500~1000g/min离心5min，弃上清。 6. 调整细胞数至0.5~0.2×106/ml。 7. 取100μl细胞悬液，加入1μlHoechst33258染液，染色10min。 8. 将10μl染色的悬浮细胞涂于载玻片，加盖玻片。 9. 放于荧光显微镜下观察。选用UV激发滤片和400-500nm阻断滤片。 10. 结果观察：细胞核呈蓝色。凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化，或玻 珠化，并可呈现DNA荧光碎片。 注意事项 | 1. 对大片段DNA不能振荡，应轻轻反复翻动离心管，以免机械剪切力损伤DNA链。 2. 收集沉淀DNA（特别是凋亡细胞的DNA）时需格外小心； 3. 样品加入样孔的位置应该合适； 4. 溴化乙锭为较强的致突变剂，应带乳胶手套操作； 5. 紫外光能损伤眼睛，不要直视光源； 6. 污染物须放入专用容器内，妥善处理。 7. Hoechst33258染液应4℃避光保存。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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