醋酸纤维素膜电泳分离鉴定蛋白质实验一电泳法
| 实验方法原理 | 混合蛋白质样品中各种蛋白质的等电点不同,在pH8.6的巴比妥缓冲液中,各种蛋白质所带的静电荷量不同,加上蛋白质分子大小不相同,在电场中移动的速度也不等,例如,血清或卵清样品中白蛋白等电点比其他蛋白质低,在pH8.6时带的负电荷比其他蛋白质多,加上白蛋白的分子较小,因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样,样品中的蛋白质在醋酸纤维素膜上就可以形成区带,可以分离和分析蛋白质组成等。另外,作为纯化了的蛋白质电泳后的区带应是一种,否则就没有纯化好。醋酸纤维素膜是对纤维素的羟基进行乙酰化而得的,将其溶于有机溶剂(丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙脂等)后抹成一均匀薄膜,则成醋酸纤维素膜,它有强渗透性,对分子移动无阻力,作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳具有简便快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。蛋白质与氨基黑10B特异结合而不与醋酸纤维素膜结合,染色一段时间后脱色,膜上没有结合蛋白质的部位就不呈色,有蛋白质的部位就颜色明显。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 血清蛋白质蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 巴比妥蒸馏水HCl氨基黑磺基水杨酸冰醋酸醋酸无水乙醇 仪器、耗材 | 电泳仪电泳槽培养皿血色素吸管铅笔尺玻片滤纸镊子 实验步骤 | 1. 膜的准备:将醋酸纤维素膜切成8cm×2cm条块(或根据需要决定薄膜大小),在薄膜一端1.5cm处用铅笔轻轻画一条线(点样处),浸入巴比妥缓冲液中至完全浸湿(大概20min左右)。用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸中间,轻轻按压,吸去多余的液体。 2. 点样:用较尖的血色素吸管或其他点样管吸取样品2～3μl涂在玻片的一端截面上(玻片宽度应小于膜宽度),然后将沾有样品的玻片截面与膜点样处轻轻接触,样品即呈一条线“印”在膜上,使样品尽量点得细窄而均匀。 3. 电泳:已点好样品的薄膜架在铺有滤纸桥的电泳槽上,使点样端靠近阴极,膜用镊子轻轻拉平不能贴在槽底。盖好槽盖,通电,控制电流强度为0.7～0.8mA/cm膜宽,当白蛋白(仔细观察可见淡黄色)移动约3cm即可切断电源停止电泳,一般为40～60min。 4. 染色和漂洗:取下膜,立即浸入染色液中10min。取出移入2.5%醋酸中漂洗脱色,每隔5min换一次漂洗液,直至膜背景无色为止(约更换3次),即可观察到清晰的电泳图谱。 5. 透明处理:待漂洗干净的电泳图谱完全干燥后(可用电吹风机吹干),浸入透明液中0.5min后,立即取出,平贴在玻璃板上,完全干燥后即成为透明的薄膜图谱,可作扫描或照相。如将该玻板浸入水中,则膜脱下,吸干水分,可长期保存。  |
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发布于 ： 2018-08-10
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