【求助】北京六一半干转膜仪的转膜条件

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【求助】北京六一半干转膜仪的转膜条件

2021-07-20

问题描述：

我想检测30KD左右的蛋白的含量，用北京六一半干转膜仪转后，用丽春红染不出条带，孵抗体也没有条带，但是跑完胶上有条带，转完膜的胶上也没有条带，不知条带去了哪里。

我的转膜条件是40mA或者20mA2小时，均无所获，各位大虾建议一下转膜条件，是不是转膜条件不行还是别的。

还有丽春红配制时，三氯乙酸有一些发潮，是不是会影响丽春红的染色效果，请多多指教！

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lgqsonic

用户

如丽春红染不出，说明蛋白没有转到膜上，胶染不出，先确定PAGE 有无问题，转膜前染下胶，如有，那就说明你的蛋白很大可能转膜时间过长，或者转膜时散热不好，蛋白降解。

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nongkeyuan

用户

你用的是什么膜啊?pvdf膜需要用甲醇处理一下goodluck!!!!!

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zhangql930611

用户

蛋白过热也可以降解的吗,我赶紧降下温试试,多谢高手指点.

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zhangql930611

用户

下午在转膜仪旁边放满了冰块，并且将电流提高到了60mA1.5h转完后，丽春红也没有染出色，而且加了一抗二抗也还是没有结果。。。唉，，，

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pummelo

用户

转膜的电流是按照膜的面积算的，我们的是5*8.5的膜，用50mA.转1h,效果还不错。我们用的也是六一的半干转膜仪。还有，我一般不用里面自带的大海绵，直接把3层滤纸放在负极板上，然后是胶，接着是膜，再盖滤纸，我么这个仪器正极再上的，不知你那个是不是.

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zhangql930611

用户

我们也是正极在上的，那转膜的电流与膜的面积是怎么换算的呢？多谢指教!

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lgqsonic

用户

一般0.8-1.3MA/CM2，即可

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zhangql930611

用户

多谢，因为这两天有个会议要参加，过十天再试，试完了再向大家汇报结果。。

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293

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buffer？

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zhangql930611

用户

buffer用转膜液

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zhangql930611

用户

buffer用转膜液

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alibort

用户

我也用过六一的半干转膜仪，也遇到你所说的情况有些心得：1。首先你一定要确定你跑SDS-PAGE的上样量在你的底物显色范围内，（如4-CN的灵敏度就《〈TMBD，知道这点我花了很强时间，开始用4-CN，后来换用TMBD就好了）2。半干转膜仪的转膜效率并不高，后来我换用了湿转感觉效果好很多3。在做半干转膜时，滤纸一定要含的BUFFER要很很少，否则会出现有些高分子量转不干净的情况，用一种含有所谓的阴极液和阳极液的BUFFER比用单一的BUFFER要好但我认为最关键的是前两点

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alcohol_ayd

用户

我们实验室用半干转法，5x8的膜，70-90mA,2-3小时，结果不错的，不过小分子量的蛋白可能会转过了

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haoyuqq

用户

1.我们实验室用砝码西亚的PVDF膜做western用立春红是肯定染不出的，NC膜可以。但是PVDF膜可以直接拿考兰染，只是这样不可逆，染完的膜就要扔了，刚开始实验时拿这个做个控制还是可以的。确定是不是你立春红的问题最简单就是直接拿张膜，上面滴一滴蛋白，湿环境孵育半小时，拿出来看立春红能染出来不。2.你检测的如果是纯蛋白，在做western之前你可以做dotblot做为预实验，关键是方便，摸摸抗体浓度，上样量什么的，直接western做不出来的话原因也不好找。我以前western时能转上但是抗体染不出来，最后用dotblot摸索出了抗体浓度才做出来。3.从你描述的western结果来看我认为可能是转膜的问题，很可能是你组装的效果不好导致，不然你的胶上不会没蛋白。

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andye

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我使用的是0.65mA/cm2,转膜2h,发现很多蛋白都未转上去,调成100mA后发现膜特别容易干,甚至出现胶变形的情况,不知道怎样处理了?

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yxrsxxk77

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展开引用zhangql930611我想检测30KD左右的蛋白的含量，用北京六一半干转膜仪转后，用丽春红染不出条带，孵抗体也没有条带，但是跑完胶上有条带，转完膜的胶上也没有条带，不知条带去了哪里。我的转膜条件是40mA或者20mA2小时，均无所获，各位大虾建议一下转膜条件，是不是转膜条件不行还是别的。还有丽春红配制时，三氯乙酸有一些发潮，是不是会影响丽春红的染色效果，请多多指教！......你好，我想问一下您的转膜条件摸索出来了吗？我最终做出来的什么也没有。膜还挺花的，有雪花。

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