方案11．细胞培养材料：取病人手术切下的病理性瘢痕组织及其周围正常组织。2.取材部位：前胸、四肢等，病人年龄从3到35岁，瘢痕生长时间为6个月到1.5年。3.采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。4．过程：在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约0.5-1mm3的小块，加入少量小牛血清，接种于培养瓶中，在95%空气,5%CO2,37°C,饱和湿度条件下培养24小时，使组织块牢固贴附于瓶壁。然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，每周两次换液。约3-4周，原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1：2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次，待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3-10代细胞。方案21.1 材料 瘢痕组织:医院整形或烧伤科或烧伤科提供。DMEM培养液(美国Gibco公司产);小牛血清1.2 方法 手术切取病人的瘢痕组织,在无菌条件下立即置入DMEM培养液(含10%FCS、青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的培养瓶中,于4h内在净化工作台内取出标本,放入加有青-链霉素的DMEM基础培养液中清洗2次,尽量去除血污及表皮与基底层,将清洗干净的瘢痕组织用眼科剪剪成0.5～1mm3的小块,分别转入2支试管内,然后分步消化培养:①单细胞培养法:将试管内组织用Hanks’液洗2次,吸出上清,加入5ml0.25%胰蛋白酶液,置37℃消化20～30min(或加入5ml0.1%胰蛋白酶液,置4℃冷消化过夜),加入2ml小牛血清终止消化,去上清液,加入10mlDMEM完全培养液,用吸管将组织吹打成单个细胞悬液,200目不锈钢筛过滤,离心去上清,Hanks’液洗2次,加入DMEM完全培养液,将细胞充分打匀,以5×105细胞接种于50ml培养瓶内,置37℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,2～3d更换一次培养液;②组织块贴壁培养法:分胰蛋白酶消化组及未消化组,消化组用0.15%胰蛋白酶液将组织块消化5～10min,去消化液,Hanks’液洗2次,去上清,加入含20%FCS的完全DMEM培养液4～6ml(视组织块量多少而定),混匀,静置数分钟,弃上清,然后用弯头吸管将消化或未消化的组织块移入用FCS湿润过的培养瓶底部,均匀散在贴壁,滴加少量的完全培养液,置37℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,3d以后再补救加2ml完全培养液,此后3～4d更换一次培养液,待纤维细胞长满瓶底时作传代培养。
