大家一起来讨论下哈~单抗分析：不同CEX方法测定同一个单抗，酸碱性及主峰比例差异

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2015-03-06

问题描述：

如题：
两个CEX方法A和B测定同一单抗，结果碱性峰比例差不多，酸性峰比例相差约7%，相应主峰也差了7%左右。
具体来说，A方法酸性峰高，主峰低，碱性峰稍微低点；B方法酸性峰低，主峰高，碱性峰稍微高点；另外也做了CIEF，结果呢和A方法更接近。
仔细比较起来，AB两个方法的峰性和数量差不多，就不知道为什么会有这么大的差异。两个方法一个用的WCX柱-磷酸缓冲液，一个用SCX柱-MES缓冲液
大家帮我分析下：
1.两个方法哪个方法更准确，是以酸性峰高的为准还是什么？为什么？
2.这显著差异是由方法造成，具体原因是什么？柱子？
3.CIEF的结果和A方法更接近，是不是可以由此证明A方法更好或者CIEF的方法更好（因为CIEF更快更方便）？
欢迎讨论~
纠正下，A方法用的是Tosoh的柱子，B方法用的是SCX柱。TOSOH的柱子是7um的填料，10cm长。SCX是10um的填料。我本人TOSOH的阳离子柱子用的很少，这次信手用用，结果发现差异很大
那我现在就考虑，在以后方法开发过程中，除了通过流动相pH和组成、梯度、柱子选择来获得样品主峰和酸碱性的最大分离，还要关注各峰比例。因为之前比较方法好坏都只看分离度，尤其是主峰和邻近峰的分离度，获得最大分离度，自然可以做到主峰尽可能纯，但从未认真比较过各峰比例。这是一个大疏忽吧！
另外，CIEF和CEX方法原理还是有点差异的，所以分的是不同的异质体，原液放行两个方法肯定是都要做的。问题就是在早期细胞株筛选和工艺开发阶段，哪个方法才是又快又准。CIEF（iCE280)一般15分钟一个样，比CEX快多了。如果CIEF测得主峰要低于CEX结果，是不是真的完全可以取代CEX呢？CEX分离出的峰远比CIEF的多！
欢迎大家继续讨论~

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royyluo

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如果是仿制药的话可以和原研药比较对照以原研药为参照标准

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wjs74

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在完全分离的情况下WCX,SCX柱做的结果应该接近，通常IEX方法很难达到基线分离，会有部分重叠和分离度的差异，使得不同方法的积分数值有变化。主峰的面积归一化百分比低的，表明异质体检出多。结果相对可靠

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jackieustc

用户

展开引用threetigers如题：两个CEX方法A和B测定同一单抗，结果碱性峰比例差不多，酸性峰比例相差约7%，相应主峰也差了7%左右。具体来说，A方法酸性峰高，主峰低，碱性峰稍微低点；B方法酸性峰低，主峰高，碱性峰稍微高点；另外也做了CIEF，结果呢和A方法更接近。仔细比较起来，AB两个方法的峰性和数量差不多，就不知道为什么会有这么大的差异。两个方法一个用的WCX柱-磷酸缓冲液，一个用SCX柱-MES缓冲液大家帮我分析下：1.两个方法哪个方法更准确，是以酸性峰高的为准还是什么？为什么？2.这显著差异是由方法造成，具体原因是什么？柱子？3.CIEF的结果和A方法更接近，是不是可以由此证明A方法更好或者CIEF的方法更好（因为CIEF更快更方便）？欢迎讨论~......在A的基础上优化，方向A的方向，B肯定是主峰不纯。准确的标准就是让主峰和其它峰尽量分开。柱子、缓冲液、流动相时间及梯度、温度都会有影响。

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cpu随风而逝

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不知道楼主有没注意过，IEC测试方法，在不同的仪器上做出的比例也会略有不同。（本人在用1200和1260时就有这个问题）这涉及到仪器适用性，仪器管路粗细等问题。那SCX、WCX她们的功能基团本就有差异，比例结果略有不同也可以理解，受影响因素太多。我个人倾向于用A方法，CIEF的结果定量是最为准确的，同时WCX的方法还是先阶段行业的金标准，认可度更高。。。另外你得注意，你检测IEC的目的。若是仿制，应尽量与原研一致，不管是方法还是结果，，做批间差异，稳定性等，是为了实现重复，选择更加稳定的方法，做到结果真实可靠。

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chenrain

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展开引用cpu随风而逝不知道楼主有没注意过，IEC测试方法，在不同的仪器上做出的比例也会略有不同。（本人在用1200和1260时就有这个问题）这涉及到仪器适用性，仪器管路粗细等问题。那SCX、WCX她们的功能基团本就有差异，比例结果略有不同也可以理解，受影响因素太多。我个人倾向于用A方法，CIEF的结果定量是最为准确的，同时WCX的方法还是先阶段行业的金标准，认可度更高。。。另外你得注意，你检测IEC的目的。若是仿制，应尽量与原研一致，不管是方法还是结果，，做批间差异，稳定性等，是为了实现重复，选择更加稳定的方法，做到结果真实可靠。......CIEF，和WCX或者SCX分的不完全一类异构体，不能就很简单地就判断其定量是最为准确的。一方面要选择分离的比较好看的图，积分嘛，大家都懂得；另一方面还要看方法能不能把你的影响质量的异构体分开，比如酸性的deamidation，碱性的二硫键相关的异构体。

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cpu随风而逝

用户

chenrainCIEF，和WCX或者SCX分的不完全一类异构体，不能就很简单地就判断其定量是最为准确的。一方面要选择分离的比较好看的图，积分嘛，大家都懂得；另一方面还要看方法能不能把你的影响质量的异构体分开，比如酸性的deamidation，碱性的二硫键相关的异构体。哦是吗？据我所知以及实验的结果显示CIEF的结果却为更加准确。另外第二点，CQA的确定，也是建立在你确定了IEC的方法后，在去富集各异构体，做定性，活性研究。你事先并不知道哪个方法更好。两张方式都做，成本和时间太大，，选定一种方法去实验，明确各异构体的理化性质及影响，已经非常符合CDE的要求了。、

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chenrain

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展开引用cpu随风而逝哦是吗？据我所知以及实验的结果显示CIEF的结果却为更加准确。另外第二点，CQA的确定，也是建立在你确定了IEC的方法后，在去富集各异构体，做定性，活性研究。你事先并不知道哪个方法更好。两张方式都做，成本和时间太大，，选定一种方法去实验，明确各异构体的理化性质及影响，已经非常符合CDE的要求了。、......CIEF是不是更准确是casebycase的，而且有些信息越早知道越好，最好不要等到分离了很久后发现有奇怪的东西出来了再去做表征。个人认为在早期研发阶段，应该多种方法都试一试，各种分析方法的开发和建立比起上游和中游所花的钱和时间。。。针对本帖lz所提的问题，个人建议lz把PepMap和DisulfideMap，GlycanProfile都做了，有些关键的质量分布就能看出来了，然后再决定哪种分离方法更符合实际的异构体的分布。

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jackieustc

用户

方法是互补的，CIEF与IEX不绝对，另外就是IEX也不是都能把你想分出的杂质峰都分出来。如果有关系到CQA的杂质峰，在一个方法中分离不开或者起不到控制作用，那就要用别的手段控制。例如高分子蛋白影响免疫原性，那必须单独控制，假如活性功能方面影响不大，那分离就是个折中，必定抗体这么大分子，不是能把所有组分都分开的，经常是几种异构体在一个峰里。

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缓冲液

酸碱缓冲液上样缓冲液电泳缓冲液其它缓冲液

生物分子