放射性标记DNA探针的制备 l聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。 lDNA的标记 1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。 2．向酶切反应混合液中加入 [α－32P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基)10μl dCTP(2mmol/L)1μl dGTP(2mmol/L)1μl dTTP(2mmol/L)1μl DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl）1μl 室温温育反应体系30分钟。 3．加入7μl10×上样缓冲液终止反应。 l标记探针的分离 1．将反应混合物上样于非变性凝胶。 2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。 3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。 4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。 5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm2）后，放入微量离心管中。 6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。 7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。 8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。 9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约104cpm/μl。 大肠杆菌感受态细胞的制备 1．用2ml噬菌体肉汤培养基培养大肠杆菌，37℃下振荡过夜。 2．接种1ml上述大肠杆菌培养液于100ml噬菌体肉汤培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4为止。 3．4℃下，3000r/min离心5分钟，用10mlTM缓冲液重悬菌体，菌体可在4℃下保存5天而不明显失去其感受态特性。 大肠杆菌的感染和蛋白合成的诱导 1．在每一直径150mm培养皿中加入70ml含琼脂的噬菌体固体培养基，制备筛选平板。平板数取决于实验设计，平板使用前在通风厨内风干2～3小时。 2．用SM缓冲液稀释噬菌体贮液至浓度为5×106pfu/ml. 3．微波炉融化上层琼脂糖，50℃保温备用。 4．在15ml带螺旋盖的管中加入600μl大肠杆菌感受态细胞，用4～6μl稀释噬菌体贮液感染，让噬菌体在室温下吸附20分钟。为实验准备足够量的样品数目。 5．加10ml软琼脂至每一噬菌体感染的大肠杆菌样品中，颠倒2～3次后倒入150mm的噬菌体平板（已在37℃预热30分钟）上。向各个方向倾斜使软琼脂完全覆盖表面，避免产生气泡。 6．室温下使软琼脂糖固化（需5分钟），倒扣平板在42℃下培养4小时。 7．在培养期间，用圆珠笔标记132mm硝酸纤维素滤膜。 8．在10mmol/LIPTG水溶液中浸泡硝酸纤维素膜几分钟，使滤膜风干，但不要完全干燥。 9．42℃培养4小时后，噬菌体平板上的噬菌斑正好可以看见。若噬菌斑还没有出现，再培养一会儿。5小时后应该能看见噬菌斑。当能分辩噬菌斑时，把硝酸纤维素膜放在平板上面，使其所作标记面对软琼脂的上表面。用防水笔在平板底部按硝酸纤维素滤膜上的标记标记上，置于37℃培养4小时。 10．重复第7和第8步以准备第二组IPTG浸泡硝酸纤维素滤膜。 11．用镊子小心将第一组滤膜从平板上移开，放置于Whatman3MM纸上，使其噬菌斑面朝上。为防止软琼脂上层的剥脱，在移去滤膜前应将平板4℃冷却5～10分钟。 12．将第二组滤膜放在平板上，在每块平板底部按滤膜上的标记标记上，在37℃培养2～4小时。 13．第二组滤膜温育期间，开始操作第一组滤膜。移开第二组滤膜后，应将平板置于4℃保存直至鉴定出阳性噬菌斑。 变性、复性和封闭 1．将含有噬菌斑的硝酸纤维素膜放在变性缓冲液中（每100ml4张滤膜），温和摇晃10分钟。 2．移去50ml变性缓冲液，加50mlDignam缓冲液，温和摇5分钟。 3．重复4次步骤2。 4．将滤膜转入新鲜Dignam缓冲液中温和振荡5分钟。 5．用结合缓冲液漂洗滤膜。 6．将滤膜放进BLOTTO缓冲液中（每100ml4张滤膜）4℃下温和振荡1小时。这一步将阻断DNA探针与滤膜的非特异性结合。 7．用Dignam缓冲液快速漂洗滤膜。 结合反应 1．将滤膜放进含有放射性标记DNA探针的结合缓冲液中，4℃下温和振荡至少1小时。 2．用结合缓冲液温和振荡漂洗（5分钟）滤膜（每100ml4张滤膜）。重复此步一到二次。用盖革计数器监测滤膜上放射性强度。除结合缓冲液必须保存在4℃外，这些漂洗步骤均可在室温下进行。 3．将滤膜放在Whatman3MM纸上，以吸去残余的液体。用Saran®膜包裹滤膜。 4．将两套滤膜对X光片在－80℃下曝光过夜。 5．放射自显影显像。 阳性噬菌斑的鉴定 1．将每张硝酸纤维素滤膜的放射性自显影照片与噬菌体平板底部的标记对齐，噬菌体表达的DNA结合蛋白将会在第一和第二张滤膜的放射自显影照片上给出信号。 2．用粗口颈巴斯德将含有阳性噬菌体的每个琼脂糖凝胶块移入500μlSM缓冲液中，4℃下放置数小时使噬菌体得以充分扩散。 第二和第三轮筛选 1．准备第二和第三轮筛选的噬菌体平板，在每一直径90mm培养皿中加入30ml含噬菌体固体培养基。平板数取决于实验设计，使用前在37℃温箱中风干2～3小时。 2．按如下步骤确定噬菌体贮液的效价 a.用在SM缓冲液稀释噬菌体贮液至10－2、10－3、10－4。 b.向5ml螺旋盖的管中加入各稀释液1μl和250μl大肠杆菌感受态细胞并混合，室温下放置20分钟。 c.用微波炉熔化软琼脂，冷却至50℃备用。 d.加4ml软琼脂入细菌/噬菌体混合液中，并全部涂布于上述噬菌体平板上。 e.室温下让上层软琼脂固化，37℃培养过夜。通过计算所形成的噬菌斑的数目来确定效价。 3．除了用100～300pfu的噬菌体或将250μl大肠杆菌感受态细胞和并涂布用4ml软琼脂90mm噬菌体平板外，按第一轮筛选的步骤进行第二轮筛选。用直径82mm的硝酸纤维素滤膜匹配直径为90mm噬菌体平板。在第二轮筛选中每块平板的阳性噬菌斑应增加。 4．用口径小的巴斯德吸管将阳性噬菌斑移开――尽量挑单个噬菌斑。将每一琼脂小块放入100μlSM缓冲液中，并使噬菌体4℃下扩散数小时。确定噬菌体贮液的效价。 5．除用两个不同的DNA探针来了解表达蛋白的结合特异性外，按步骤3所述程序进行第三轮筛选。为方便起见，将带有噬菌斑的滤膜切成两半，一半与野生型探针保温，另一半与含有突变的DNA结合位点的探针保温，序列特异性DNA结合蛋白将与野生型作用而不与突变型探针作用。
