Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳 Aptamer识别肿瘤细胞 若选择4℃识别,则需要提前控温离心机,且样品在上样检测前宜放置于冰中;37℃就不用控温了。Aptamer浓度:荧光标记的是50μM,没有标记的是100μM DNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套,穿好实验服,以防苯酚粘到皮肤上。 1.取7.3μlaptamer(100μM)于1460μl小鼠血清(无需过滤)中,在37℃细胞培养箱中孵育; 2.于不同时间点(6h,5h,4h,3h,2h,1h,1min)取200μl该小鼠血清到新的EP管中,加入200μl(等体积)的苯酚-氯仿(取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀),混匀,管中溶液变浑浊;3.用15000转/分离心10分钟,管中出现3层:上清、白色变性蛋白层、苯酚层; 4.取上清到新的EP管中。在原EP管(变性蛋白层和苯酚层)中加入200μlTE溶液,混匀(该步进一步提取残留的DNA); 5.用15000转/分离心10分钟,收集上清;6.重复4、5步直到上清澄清; 7.在上清中加入等体积的氯仿(用于去除苯酚),混匀,用15000转/分离心10分钟,取上清到新的EP管中;8.加入等体积乙醚(用于去除氯仿),混匀后静置10分钟,弃上层乙醚(乙醚比水轻,在上层);9.重复步骤8,敞开管盖15分钟,待乙醚挥发; 10.加入1/10体积的3MNaAc、2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃冰箱中30分钟(DNA沉淀);11.用16500转/分(转速不宜再高,EP管容易破裂!)离心30分钟; 12.将管中溶液吸出,转移至新的EP管中。原管中保留约30μl溶液,打开管盖,待管中溶液蒸发;(我通常将EP管敞开,封上封口膜,再扎7、8个孔,放在通风橱中过夜。)(管底看不到沉淀,因为DNA含量太低。)13.在管中加入16μL1*TE溶液; 14.进行电泳分析前,将样品在95℃水浴中加热10分钟(小心管盖冲开或进水),在冰上骤冷(使DNA成单链),上样或保存在-20℃冰箱中。 聚丙烯酰胺凝胶电泳------注意实验中戴好手套!!!