细菌形态学检查实验一革兰氏染色法
实验方法原理 | 细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌(G+)细胞壁肽聚糖层数多,且肽聚糖为空间网状结构,再经乙醇脱水,网状结构更为致密,染料复合物不易从细胞内漏出,仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌(G-)细胞壁脂类含量多,肽聚糖层数少,且肽聚糖为平面片层结构,易被乙醇溶解,使细胞壁通透性增高,结合的染料复合物容易泄漏,细菌被脱色为无色,再经石炭酸复红稀释液复染成红色。 | ||||||||||
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实验材料 | 金黄色葡萄球菌24h斜面培养物大肠杆菌24h肉汤培养物 试剂、试剂盒 | 革兰氏染色液生理盐水 仪器、耗材 | 载物玻片接种环 实验步骤 | 一、方法 1. 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片:用镊子从载物片缸中取出经3%盐酸酒精脱脂的载物玻片,用擦片布擦净,然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈,做为涂膜的标记范围。 2. 点燃煤气灯:先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上,再把管道的煤气开关打开,然后把煤气灯的煤气口稍稍开放,立即用火柴点燃之,适当调节煤气孔和通气孔,使火焰长度在8~10cm,并能分清内外焰为止。 二、步骤 1. 涂片:按无菌操作取材法进行,具体步骤如下: 用肉汤培养物涂片: (1)右手拿接种环的黑色塑料柄部分,左手托持试管。 (2)将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌,直到把金属丝烧红(图1-2),然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 (3)用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞,并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 (4)用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3),此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 (5)将试管口再次灭菌,棉塞也要在火焰上略加烧灼(时间要短以免点燃棉塞),塞好棉塞,放回原处。 (6)将接种环上之材料涂于载物片上,随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境,接种环灭菌前,须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中烧红灭菌,杀死残留的细菌。 用斜面培养物涂片: 用细菌斜面培养物涂片,需预先取一接种环生理盐水放在载物片上,然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔,在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液,再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。 2. 干燥 放空气中自然干燥。如欲加速,也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤,但切勿将涂膜烤焦。 3. 固定 用染色夹子夹住涂片,在火焰的最热部分连续通过三次,以固定之。此时杀死大部分细菌,并使标本固定于玻片上,以免在染色或水洗过程中被冲掉。 4. 染色 ①将结晶紫染液加于涂膜上,染色(初染)1min。 ②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。 ③水洗后用95%酒精脱色,脱色时频频摇动玻片,直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。 ④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。 ⑤水洗,用滤纸轻轻吸干,待标本充分干燥后进行镜检。 染色过程中,水洗要用自来水的细流徐徐冲洗,冲洗涂膜的背面,勿使强水流直接冲到涂膜上。 三、结果观察 使用油镜观察,注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何,最后判定染色性,哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色),哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。 将在标本中观察到的细菌形态和染色性,用有色铅笔画出模式图,并附以文字说明。 注意事项 | 1. 酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节,如脱色过度,则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌,如脱色不够,则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌,所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响,一般涂片时取菌要少,涂片薄而均匀为好。 2. 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果,如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率,所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。 其他 | 一、革兰氏染色液的制备 1. 结晶紫染液 用天秤量取结晶紫5g放乳钵内研碎,一面研磨一面徐徐加入95%酒精使之溶解。加入酒精全量为100ml,制成酒精饱和液(原液)。取原液20ml,与1%草酸铵水溶液80ml混合,用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。 2. 芦戈氏碘液 碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300ml 配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾,然后加碘使其全溶解,最后加蒸馏水至300ml。供革兰氏染色媒染用。 3. 稀释石碳酸复红染液 首先,取碱性复红10g和95%酒精100ml,按上述方法同①制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10ml,与5%石碳酸水溶液90ml混合,用滤纸过滤,再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。 二、常见的与医学有关细菌的革兰氏染色性 |
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发布于 : 2018-08-06
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