番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验 步骤2～7须在4℃下使用高压灭菌过的设备进行。 1．将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上，置于小盆内，用薄膜封口后，培养7天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。 2．将40～50g新鲜组织放入300ml匀浆缓冲液，用韦林氏搅切器先1×4秒而后6×1秒。 3．过滤匀浆混合液，使其透过漏斗上的4层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放置的3层Nitex尼龙筛网（300μm，100μm，52μm），汇入大烧杯中。全部匀浆物均滤完后把纱布集中在一起，将纱布上的滤液压入尼龙网，并使其经漏斗流入烧杯中。切勿将滤液压出尼龙网，亦不可使用抽滤，让滤液靠重力作用下流。 4．将每批滤出的匀浆倒入500ml离心瓶中，用SorvallGS－3转头5000r/min（4225g），4℃离心20分钟。 5．吸去上清，然后将核粗提沉淀物用大口径塑料巴斯德吸管温和地反复吹吸，使沉淀悬浮于匀浆缓冲液中。将重悬起的沉淀转入50ml离心管中，用匀浆缓冲液调节体积至约40ml。 6．4℃用SorvallSS－34转头4000r/min（1912g）离心10分钟，再次沉淀细胞核。重复步骤5和6三次，分别在3500r/min离心10分钟，8分钟和6分钟。最后一次离心后，尽可能洗净匀浆缓冲液。 7．将核悬浮于核悬浮缓冲液中，按每50g植物组织加0.5ml核悬浮缓冲液。用液氮冷冻，保存于－80℃。若核蛋白抽提即将进行，可不必将核冷冻起来。 核抽提物的制备 1．将细胞核置于冰上解冻，精确测定核悬浮液的体积。 2．加入核裂解缓冲液，使NaCl终浓度为0.47mol/L（即，每毫升核悬浮加入182μl核裂解液）。 3．将核悬浮液置于摇床上，4℃温和摇动30分钟。 4．4℃微量离心20分钟沉淀染色质。 5．小心移出上清，避免搅起胶状的含DNA的沉淀，以使抽提液中避免含有此类杂质。 6．4℃透析上清3～4小时，中间换几次透析液。 7．将透析液用液氮冷冻，再置于冰上解冻，4℃微量离心或用SorvallSS－34转头10000r/min（12000g）离心15分钟，弃沉淀，保留上清。此步骤是为了将其余可能在浓缩步骤中阻塞微量浓缩器的蛋白质沉淀除去。 8．用CENTRICONTM10微量浓缩器浓缩上清，以使提取液中蛋白质的终浓度为1～3mg/ml。可以溶菌酶为标准物用Bio-RadBradford-based蛋白质分析试剂盒来测定蛋白质浓度。经验表明，要达到上述浓度，至少需要浓缩2～3次。 9．留出待作迁移分析的核抽提物，将剩余部分用液氮或干冰冷冻，贮于－80℃备用。 DNA片段的标记 l聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．安装凝胶装置并洗净玻璃板。 2．配制4％丙稀酰胺凝胶液，将以下成分混合： 丙稀酰胺/双丙稀酰胺（29：1）4ml TBE（10×）3ml APS（10％）200μl TEMED40μl 制备厚1mm的凝胶，并保证上样孔可容纳25μl样品。凝胶聚合约需1小时，制好后，使用前可于室温放置1天。 l探针的标记 1．按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管中： EcoRI酶解的质粒DNA（1μg或约800fmol末端）2.5μl Sequerase®缓冲液（5×）2.0μl [α-32P]dATP（6000Ci/mmol）3.0μl 二硫苏糖醇（0.1mol/L）1.0μl 双蒸去离子水（ddH2O）0.5μl Sequerase®酶（用4倍Sequerase®稀释缓冲液稀释）1.0μl 总体积：10μl 2．室温放置15分钟。 3．加入0.5μldNTP混合物，充分混匀。 4．室温放置15分钟。 5．加入90μl0.35mol/L的乙酸钠并充分吹吸混匀以终止反应。 l测定掺入的放射性活度 1．取5μl标记反应混合物移至一新管中。将2μl此混合物点加到DE81滤膜上，再将该滤膜浸入盛有约20ml0.5mol/L磷酸钠（pH7.0）的烧杯中。再取第二张滤膜重复上述操作。 2．将烧杯置于平面振荡器上，使溶液温和振荡5分钟，将缓冲液倒入放射性废弃物中。 3．用新缓冲液重复两次清洗步骤。 4．用双蒸水漂洗滤膜5分钟，再用双蒸水重复漂洗两次。 5．用95％乙醇洗滤膜5分钟。 6．使滤膜完全干燥，再将每一张滤膜移入闪烁计数管，加入闪烁混合物，计数。 7．计算理论掺入的最大比率。计算方法如下：1）每个反应可标记400fmol质粒DNA。2）标记反应在EcoRI酶切的质粒DNA两端进行，每个末端可掺入两个脱氧腺苷磷酸残基。3）因此，每400fmol质粒DNA可结合1600fmol标记核苷酸。4）标记核苷酸的比活性是6000Ci/mmol，即13000cpm/fmol。5）因此，理论最大掺入值为每400fmol质粒DNA13000cpm×1600fmol＝2.08×107cpm或每400fmol片段1.04×107cpm。注意，仅掺入量的一半包含在待测片段中。随后的酶解反应会释放出一端标记的待测DNA片段和一端标记的载体DNA。 l标记探针的分离 1．加95μl酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）于剩余的95μl标记混合物中。充分混匀。 2．室温离心3～5分钟以分离酚相与水相。 3．小心取85μl上层水相于另一干净离心管中，将盛有酚相的离心管弃入放射性废弃物中。加入200μl95％乙醇于水相中，旋紧管盖后，涡旋混匀。 4．将离心管于碎干冰上放置15～20分钟，然后离心20分钟。 5．用移液器，小心将含乙醇的上清弃于放射性废弃物中。加入600μl80％乙醇洗涤沉淀，离心1～2分钟，用移液器弃去乙醇。 6．用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀2～3分钟。 7．将沉淀用20μl1×Sequenase®缓冲液重悬，再加入0.5μl10units/μl的PstI将标记的DNA片段从载体DNA上切下。37℃温育30～60分钟。 8．加入2.5μl高EDTA10×凝胶染液于酶解混合物中。向先制好4％丙稀酰胺凝胶中上样，然后用1×TBE缓冲液在大约10V/cm电压下电泳约2.5小时。电泳时间取决于标记片段的大小。目的是为了很好地分离标记片段与质粒载体，但切勿使目的片段跑出胶外。 9．电泳后，小心地把凝胶用保险膜包裹好，对X光片曝光5～10分钟。使用Sharpie®或其他防水标记物标记胶片及凝胶边缘，以便胶片显像之后可根据标记使凝胶与胶片重合。 10．切下凝胶上对应地标记DNA的条带，置于1.5ml离心管中。4℃下用300μl洗脱缓冲液温育凝胶薄片过夜，以洗脱DNA。将洗缓冲液移取至另一干净的离心管中。再向凝胶管中加入250μl洗脱缓冲液。－80℃冷冻再解冻，然后将洗脱缓冲液取出与前一次洗脱的溶液合并。将合并后的洗脱液离心10分钟以沉淀聚丙稀酰胺的小碎片。移取上清至另一干净离心管中，用2倍体积的95％乙醇沉淀DNA，碎干冰上放置20分钟，然后离心20分钟。弃上清，用约500μl80％乙醇洗沉淀。用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀2～3分钟。 11．将纯化的DNA片段重悬于20μl片段重悬缓冲液中。取一小等份计数测定回收的片段fmol数。一般情况下，大约可以回收原初标记量的50％。从凝胶中洗脱的效率大约为80％，但是收率会因DNA片段的大小而异。纯化的DNA片段可在4℃最多可以保存2个星期。 迁移率变动分析法 l聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．组装电泳装置并洗净玻璃板。 2．按下表配制4％非变性丙稀酰按凝胶溶液： 丙稀酰按/双丙稀酰按（29：1）4ml TBE（10×）3ml APS（10％）200μl TEMED40μl 可灌制成1～1.5mm厚的凝胶。凝胶聚合约需1小时，使用前可于室温下保存1天。 lDNA－蛋白质结合反应 1．将10mg/ml的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)贮液用无菌双蒸馏水稀释成终浓度6μg/μl。将6μg/μl的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)溶液与32mmol/L（pH8.0）的EDTA等体积混合，配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将32P标记的DNA片段稀释至终浓度2fmol/μl。 2．对于标准DNA-蛋白质结合反应，按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管： 32P-标记DNA片段（2fmol/μl）0.5μl poly(dI-dC)•poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液0.5μl 核抽提液和/或透析缓冲液9μl 总体积10μl 吹吸混匀。 3．室温温育45分钟，此时可将凝胶在100V预电泳10～15分钟。 4．温育结束后，可不加染液直接将样品加在凝胶上。在一个小样孔中单独加入10μl含0.05％二甲苯青和0.05％溴酚蓝的透析缓冲液用来跟踪电泳进程。 5．用1×TBE缓冲液在约10V/cm条件下电泳约2小时。具体时间取决于所使用的DNA片段的大小。 6．小心地把凝胶转移到Whatman3MM滤纸上并用保鲜膜覆盖在凝胶上。80℃用凝胶干燥器干燥凝胶约1小时。 7．室温下把干燥凝胶对X光片曝光过夜。 DNaseI足迹分析法 l聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．组装制作测序胶所需装置并洗净玻璃板。 2．按下表配制4％非变性丙稀酰按凝胶溶液： 丙稀酰按/双丙稀酰按（38：2）11.3ml 尿素31.5g TBE（10×）3.75ml APS（10％）300μl TEMED30μl 灌制凝胶。此凝胶聚合约需2小时。使用前可在室温下存放1天。 lDNA－蛋白质结合反应 1．将10mg/ml的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)贮液用水稀释成6μg/μl，等体积混合6μg/μlpoly(dI-dC)•poly(dI-dC)和32mmol/LEDTA（pH8.0），配制成poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液。将32P标记的DNA片段用片段重悬缓冲液稀释成2fmol/μl。 2．对于标准结合反应，将以下试剂按下表顺序逐个加入1.5ml微量离心管： 32P标记DNA片段（2fmol；通常约20000cpm）1μl poly(dI-dC)•poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液1μl 核抽提液和/或透析缓冲液18μl （含20～50μg蛋白质，具体用量取决于抽提物中DNA结合蛋白的活性） 总体积20μl 吹吸混匀。 3．室温温育30分钟。温育过程中，用DNaseI稀释缓冲液稀释DNaseI。（对于标准结合反应，稀释后的DNaseI的浓度为20μg/ml） 4．每管结合反应混合液中加2μl稀释的DNaseI溶液，吹吸混匀（标准结合反应中，DNaseI的终浓度为2μg/ml）。室温温育10分钟，从第一次加样入结合反应混合液终起开始计时。 5．加入80μlDNaseI终止液和100μl酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）以终止酶解反应。 6．振荡每管样品数秒，注意微量离心管管口应旋紧。室温离心3～5分钟。 7．每管移取85μl上层水相至另一新管，将含酚相的离心管作为放射性废弃物丢弃。向每管水相中加入200μl95％乙醇，略作振荡后，将管置于碎干冰上放置15～20分钟。 8．离心20分钟，小心弃上清。向每管沉淀加入500μl85％乙醇。离心2～3分钟，小心弃去上清，干燥沉淀。 9．将沉淀在真空离心蒸发浓缩器中干燥约5分钟（确保沉淀干燥彻底）。每管中加入3μl甲酰按染液，用Eppendorf振荡器或涡旋混匀。 10．煮样品3分钟后，立即置于冰上冷却。稍作离心，使样品汇集于管底，再放回冰上。上样于6％测序胶，然后用1×测序TBE缓冲液，在45～50℃3000~4000V下电泳，直至溴酚蓝走到凝胶底部。电泳过程中，为保持凝胶温度在45～50℃，可能需要加大电压。 11．甲醇/乙酸/H2O（5：5：90）固定凝胶15分钟后，将胶移至Whatman3MM滤纸上用凝胶干燥器干燥。 12．把干燥凝胶对X光片在－80℃曝光过夜，需使用增感屏。
