相互作用在生理上的证实和探索 l通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1.用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15min。 3.收集上清(约30ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。 4.加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液,4℃摇动免疫沉淀物30min。 5.用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。 6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4min。 7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10mA的恒定电流下电泳过夜。 8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml50%乙腈洗两次,每次3min。 10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。 11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。