免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：
（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；
（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；
（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
实验步骤：
一、试剂准备
1. 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。
2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS.
3. 加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。
4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）。
5. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
6. 准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
7. 每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
8. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子。
9.（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。
10. 用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl）。
11. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。
12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育。
13. 加入100μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl「过渡抗体」（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。
14. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800μl/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS.
15. 用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60μl足够上三道）。
16. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
二、免疫共沉淀反应
1. 转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4°C，最大转速离心30min后取上清；
2.取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
3.取10μlproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min；
4将预处理过的10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；
5.免疫沉淀反应后，在4°C以3,000rpm速度离心3min,将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；
6.SDS-PAGE，Westernblotting或质谱仪分析。
三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15;
3.收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；
4.加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；
5.用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；
6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；
8.通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；
9.从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min；
10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；
11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
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