标记抗体的应用技术一化学发光免疫分析
| 实验方法原理 | 尽管辣根过氧化物酶（HRP）可以催化Luminol-H2O2反应体系产生化学发光，但由于该体系的检测灵敏度不够高，不能满足酶联免疫测定的要求。因此，为了提高体系的检测灵敏度，可将HRP催化H2O2氧化曙红（Eosin）的反应与该反应产物增强HRP催化luminol-H2O2的化学发光反应相偶合，建立偶合放大化学发光酶联免疫分析法。这里，酶的活性是基于下列发光反应进行检测的 HRP luminol＋H2O2───→产物＋hν 产 物 ↑ Eosin＋H2O2 ────┘ HRP | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 抗体抗原血清 试剂、试剂盒 | NaHCO3缓冲液抗体稀释液 仪器、耗材 | 加样器试管聚苯乙烯珠洗瓶、抽滤装置 实验步骤 | 1. 包被抗体 在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300μl用0.05M，PH9.6碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4℃过夜。 2. 洗涤 用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3次，每次加2ml，放置3～5min，用抽滤针头吸干管内液体。 4. 洗涤 同2。 5. 加酶标抗体 用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37℃孵育2h。 6. 洗涤 同2。 7. 化学发光测定 给每管加入300μl底物溶液，置37℃保温20min。然后将小试放入LKB-1250lumimeter中，并置于测量位置，加入300μl5.0×10－4Mluminol。记录仪记录化学发光强度。 8. 同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。 注意事项 | 1. 洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反应，而影响测定结果。 2. 实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。 3. 为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。 4. 当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。 5. 底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15min达到平衡时，牷学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15min后加luminol进行化学发光测定。 其他 | 一、结果判定 1. 定性 按下列公式判别阴、阳性 L样品－L空白 ┌≥2.1 为阳性 S/N＝──────── ＝ 商│ L阴性对照－L空白 └＜2.1 为阴性 2. 定量 以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。 |
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发布于 ： 2021-07-24
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