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方案27.11 单克隆抗体的制备
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理使用聚二乙醇(PEG)将抗原免疫过的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(P3.653)进行融合。用HAT选择性培养基筛选杂合的克隆株(杂交瘤细胞)。融合后10~14天用ELISA对上清液进行筛査(ELISA筛査方法必须在融合前就已掌握),然后对理想的杂交瘤细胞加以扩增、冷冻和亚克隆,以确保其单克隆特性。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
免疫动物

1.在进行初次注射前(0天),先采小鼠血,检测血清背景抗原的反应性。

2.使用弗氏佐剂((明矶或完全/不完全弗氏佐剂;Sigma):有关这些佐剂及其他佐剂的详述可见Vogel及Powell(1995)的评述)乳化抗原(最佳剂量为125μg/小鼠;小剂量抗原可与锁眼型血蓝蛋白素(KLH,Sigma)进行耦联,以增加其抗原性),或按1:10与明矾混合旋振抗原,经腹腔将抗原分3次接种(免疫)A/J或Balb/c小鼠,接种剂量如下:



3.在第35天时采小鼠血,用ELISA法测定血清中抗体的效价。

4.将血清顺序稀释至1:4、1:30、直至1:30720。

5.选择含最高效价抗原的小鼠,以备融合使用。

6.在融合前3天,对相应动物加强免疫,即静脉注射10μg或者腹腔注射25μg抗原。

骨髓瘤细胞

1.为了便于操作,选择周一给予小鼠加强免疫,周四即可进行融合。

2.用MEM+10%胎牛血清+氮杂鸟嘌呤培养基培养P3.653骨髓瘤细胞(此种背髓瘤细胞系不分泌免疫球蛋白,非常适用于融合反应(P3.653细胞ATCC有售))。

3.融合前三天,每天将P3.653稀释至3.5X105个/ml。

T细胞耗竭(depletion)

1.自血清效价稳定的小鼠采血后,引颈处死。

2.无菌操作下取出脾脏,放入一个盛有5ml灭菌D-PBSA的培养皿中。

3.用两个1ml注射器所带的23G针头小心地拨碎脾脏,不要用力过猛,以免夹带出大量的成纤维细胞。

4.将细胞移至一个15ml的锥形管中,使凝块沉降。

5.取未聚集成块的脾细胞,移至一个50ml的锥形管中,用Unopette按1:100稀释,血球计数板计数细胞。

6.200g离心8min。

7.将细胞沉淀于0.84%NH4Cl(约需10ml/脾脏)中制成悬液,置4℃15min,以溶解红细胞。

8.在细胞悬液表层铺加14ml马血清,然后450g离心8min。

9.在50mlTCD(T细胞耗竭)缓冲液((Hank’s液)平衡盐溶液+10mmol/LHEPES+0.3%BSA)中将沉淀再次悬浮,以200g离心8min。

10.T细胞的衰竭。用含抗-Thy1.2溶液(在TCD缓冲液中加1:500的抗-Thy1.2,过滤除菌)将上述细胞沉淀制成终浓度为1X107个/ml的悬液。

11.4℃ 静置45min,然后200g离心8min。

12.将沉淀以稀释后的家兔补体液制成悬液。

13.37℃培养45min。然后以200g离心8min。

14.通过台盼蓝染色计数细胞(见方案22.1)。B.细胞回收率应为30%~50%。

融合

1.将骨髓瘤细胞和脾细胞在一个50ml离心管中混合次融合所需的脾细胞最多为1.2X108个。将脾细胞与P3.653骨髓瘤细胞以4:1比例混合;即每次融合的P3.653细胞最多为3X107个。

2.细胞悬液以200g离心8min。

3.轻轻弹击,将沉淀物充分打散,加入1mlPEG(PEG(聚乙二醇):于56°C水浴中将10.5mlPEG1450(Sigma)溶解,加入19.5ml无菌温热的MEM(pH为8.3~8.7);充分混合;拧松瓶盖,融合前平衡5~7天),融合时间至少15s。

4.轻柔地振荡混匀液75s,悬浮细胞。

5.加入1mlSFM(MEM置于室温平衡,松开瓶盖使培养基中的CO2完全释出;pH需为碱性),至少15s,轻摇振荡45s。

6.加入2mlSFM,至少30s,轻摇振荡90s。

7.加入4mlHAT培养基(基础培养基,如MEM或RPMI,加10%FBS和20%脾细胞条件培养基,与HAT储存液((10mmol/L次黄嘌呤,40μmol/L氨基蝶呤,1.6mmol/L胸苷):取1.36g次黄嘌呤、729μl氨基蝶呤(取自25mg/ml储存液)、0.387g胸背以及0.022g甘氨酸,溶于4ml的5mol/LNaOH+26ml超纯水中。用超纯水补至1L,过滤除菌)混合(稀释到终末1:100)),至少30s,轻摇振荡90s。

8.最后,加入8mlHAT培养基,至少30s,轻摇振荡90s。

9.将上述16ml混合液移入一个无菌的Nalgene瓶中,瓶中预盛HAT培养基(如果以最大量融合细胞,则需预盛125mlHAT培养液,换言之如果该16ml细胞悬液中含有上述第1步中提到的最大融合细胞密度的话(即1.5X108个),需要补加125mlHAT培养基,则瓶中总体积为141ml,加上第10步离心洗涤所需培养基,终体积为150ml,细胞浓度为1X106/ml)。

10.将50ml离心管用9mlHAT淋洗后,移到瓶中。

11.将瓶内各成分混匀,将细胞悬液移至消毒的多道盛液池。

12.使用12道加样器,按200μl/孔的量将细胞接种到96孔培养皿上,每孔的细胞总数为2X105/ml。

杂交瘤的筛选

1.融合5天后换液,将原培养基尽量吸去,重新加入新鲜HAT培养基(150~200μl/孔)以维持细胞生长。

2.每周换液两次。

3.融合后两周,通过ELISA法筛査阳性杂交克隆。

4.再经48h,重新进行ELISA检测,以确定该阳性克隆。

5.在96孔板上划出两个孔,将抗体分泌最高的(阳性)杂交瘤细胞克隆移入这两个孔内,加含10%FBS及HT的培养基培养。

6.重新检测细胞。在一个24孔板上扩增培养阳性杂交瘤细胞,在撤去HT培养基(用基础培养基将100XHT储存液(取0.408g次黄嘌呤、0.1161g胸苷和0.0067g甘氨酸,溶于2ml5mol/LNaOH+8ml超纯水中,用超纯水补液至300ml。过滤除菌)稀释(同上述HAT培养基))时,取2ml培养上清进行筛査。此步骤中,应取足量的上清,进行多次重复测定,以确定该抗体是所免疫抗原的特异产物。

7.于24孔培养板分出4孔,进行杂交瘤细胞的扩增,并冷冻保存细胞(见方案20.1)。

8.于一个75cm2培养瓶中再次扩大培养杂交瘤细胞,之后再次冷冻保存。
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