基本方案1多克隆抗磷酸肽抗体的制备

材料

BSA-琼脂糖亲和基质（Sigma)填装（如辅助方案2)于柱床体积IOml的层析柱

磷酸化酪氨酸亲和基质层析柱（IOml柱床体积；见辅助方案3)

磷酸肽-BSA偶联物免疫家兔的粗制血清

PBS/叠氮钠.•含有0.02%(m/V)叠氮钠的PBS(附录1)(可长期保存于4°C或室温）

3mol/LNaSCN

同种非磷酸肽亲和基质层析柱（3ml柱床体积；见辅助方案1和2)

同源磷酸肽亲和基质层析柱（可选；3ml柱床体积；见辅助方案1和2)

阳性选择的磷酸肽亲和基质层析柱（3ml柱床体积；见辅助方案1和2)

3.5mol/L和4.5mol/LMgCl2(可选）

透析袋（MWCO12000〜14000;宽10mm，直径6.4mm;如Spectrum的Spectra/Por4)

注：所有以下的层析步骤均在室温下进行，液体均以重力作用上柱。

1.将洗涤后的BSA-琼脂糖与磷酸酪氨酸亲和基质层析柱相连。

2.将15ml的粗制血清通过重力作用流过两柱，以PBS/叠氮钠洗，直到所有黄色血清均通过层析柱（或以分光光度计测流出液的A28。吸光度，直至达到基线）。再以5〜IOmlPBS/叠氮钠洗柱，收集所有穿出液，其中可能含有目的抗体。

每一次过柱后血清的体积会增加，这将延长下一次过柱的时间。如果通过观察血清的黄色程度来确定液体流穿的进程，则血清越被稀释后就越不容易观察。

3.可选：留取部分粗制血清组分及第一次的穿出液，用于后续分析及对比每一次纯化的组分。如果有必要，可立即通过免疫印迹对含有多种磷酸化酪氨酸蛋白的样本进行分析（单元12.5)，以排除无反应的组分。也可以留取部分纯化的组分用于接下来的分析，然后继续下一步骤。

4.血清过柱后，以10倍柱床体积的3mol/LNaSCN和10倍柱床体积的PBS/叠氮钠再生柱子，4°C保存于PBS/叠氮钠中备用。

5.将穿出的血清组分尽量多次过同种非磷酸肽亲和基质柱，以尽量减少交叉反应。以10倍柱床体积的3mol/LNaSCN和10倍柱床体积的PBS/叠氮钠再生柱子。分析每次或多次过柱的血清或保留部分组分待以后分析。

6.如果预期与同源的磷酸蛋白有交叉反应，则使用步骤5中提供的方法使穿出的血清组分通过同源磷酸肽亲和基质柱。

7.在收集阳性选择亲和纯化的穿出峰之前，将25cm的透析袋水化并洗涤。透析袋一端用透析夹夹紧，检查是否渗漏，配制6LPBS/叠氮化合物，4°C保存用作透析液。

8.将上次层析步骤所得到的流穿血清通过阳性选择的磷酸肽亲和基质柱3次（使抗体亲和基质的相互作用最大化），在每次之间不需洗柱。

9.收集最后一次穿出的血清，用5〜20ml的PBS/叠氮钠洗柱（根据柱前体积和柱床体积），将洗涤物与流穿的血清合并，另用20ml的PBS/叠氮钠洗柱，收集流穿液体作为「洗涤」峰。

10.以多种促溶剂洗脱：可以选用20ml3mol/LNaSCN(最佳选择）或10ml3.5mol/LMgCl2(可能会产生沉淀，减慢流速）洗脱后加IOmU.5mol/LMgCl2洗脱。开始洗脱时，立即收集每份3ml洗脱液到步骤7中准备的透析袋中，用透析夹将近端的袋口夹紧并立即投入PBS/叠氮钠透析液中。或者也可以收集3ml洗脱液到透析管中，一旦收集每一组分完毕，立即将透析液加人透析管中。收集至少6个组分（大多数抗体在前3个组分中，2〜3个柱床体积），如前所述再生柱子（步骤4)。

11.在PBS/叠氮钠中于4°C对步骤10收集的所有组分进行彻底透析。

12.检测280nm吸光度或用蛋白比色法测定透析后组分的蛋白质浓度，并计算产量（15ml血清得到>lmg纯化抗体）。分装抗体保存于一70°C，正在使用的抗体保存于4°C。

13.用ELISA(单元LI)或免疫印迹（单元12.5)分析最终样本以及以前步骤中保存的纯化组分的反应性和交叉反应性。

基本方案2制备抗磷酸肽的单克隆抗体

材料（带V项目见附录1)

融合后的候选杂交瘤细胞系（单元1.3)

DMEM/HT完全培养基

筛选稀释液

同种磷酸肽-BSA偶联物（作为ELISA抗原；辅助方案1和单元13.1、单元13.3)

阴性对照：用于制备杂交瘤细胞系小鼠的免疫前血清

阳性对照：用于制备杂交瘤细胞系小鼠的免疫血清

同种非磷酸酪氨酰基肽-BSA偶联物（作为ELISA抗原；单元13.1、单元13.3)

非同种磷酸酪氨酰基肽-BSA偶联物（作为ELISA抗原；单元13.1、单元13.3)

BSA偶联的同源磷酸肽（可选；作为ELISA抗原；单元13.1、单元13.3)

96孔聚苯乙烯组织培养板

网格记录纸

1.用HT培养基将融合的候选杂交瘤细胞系以低密度（目的是达到每3个孔1个细胞）接种于96孔聚苯乙烯组织培养板（单元1.3)，2周左右测定，通过记录96个网格记录纸上每个孔上的克隆数目来鉴定所有单克隆杂交瘤培养孔，作为可能的候选株，为便于鉴别，在每个含有单个克隆的孔的下方做标记。

2.使用无菌技术，从每个可能候选株的孔中移出等份上清（如从2004中移出IOOmI)至另一个96孔板（筛选板）中，在网格记录纸上记录原始板的编号、孔的位置以及相对应板的编号、孔的位置。原始孔每孔再补加以100ul，37°C预热的新鲜HT培养基。如果需要，用亮色的孔状大小的胶贴粘贴在板盖表面以示标记。如果上清没有立即进行检测，则将筛选板塑料袋包好存放于4°C。

3.筛选板中每孔上清液加入150ul筛选稀释液（防止微生物污染并扩大体积）。

4.以同种非磷酸肽-BSA偶联物为抗原进行ELISA(单元1.1)，对筛选板中每一候选杂交瘤上清的部分组分（如50M1)进行筛选。记录每个阳性样本筛选板的编号、孔的位置以及相对应的原始板编号、孔的位置，同时测定融合用小鼠的免疫前血清(阴性对照）和同一只小鼠的免疫血清（阳性对照），在HT培养基：筛选稀释液1:1混合液中按1:100稀释。同时也对空白筛选稀释液进行ELISA检测（作为附加的阴性对照）
。
5.以同种非磷酸肽-BSA偶联物为抗原，顺次或同时对步骤4筛选出的每个阳性样本的部分组分进行ELISA(单元1.1)检测，以剔除非磷酸化反应性的克隆；以非同种无关磷酸酪氨酰基肽-BSA偶联物为抗原进行ELISA检测，以剔除具有其他磷酸酪氨酸反应性的克隆。此外，如果预期可能与同源磷酸化蛋白有交叉反应，则以BSA偶联的同源磷酸肽为抗原以剔出任何可能的同源磷酸化蛋白交叉反应。如果有必要，也可以同时筛选具有非磷酸化同种肽的特异反应性的克隆。

6.将克隆扩大培养，以满足筛选所需的所有试验。冷冻部分组分备用。通过有限稀释(单元1.3)对剩余的细胞进行亚克隆。

7.如步骤4和5,筛选亚克隆的上清，检测抗体的持续分泌和特异性。将具有代表性的独立亚克隆与其原始的母代克隆区分开来，因为难以预测每个母代单克隆抗体是否能够识别同种磷酸化全蛋白，或者能否用于日后的各种类型免疫检测。扩大培养和冻存候选亚克隆。最好经过多轮传代和冻存、复苏、再扩大培养后，连续检测抗体的特异性和分泌持续性（推荐）。

8.进一步对亚克隆进行鉴定，选取最有用的克隆，分析培养上清液在特定的免疫检测(如免疫共沉淀，如单元12.2中所述；或免疫印迹，如单元12.5中所述）中与同种磷酸化全蛋白的反应性。

9.可选：将目的克隆大量培养获取培养上清制备抗体，并进行亲和纯化（见基本方案1)，或制备腹水（单元1.4)，腹水可通过硫酸铵沉淀而后进行亲和纯化。如果有必要，可以利用商业化的试剂盒（如Pierce或Sigma)进行亚型分析。

辅助方案1肽的合成

目前，大多数含磷酸酪氨酰基的肽是利用9-芴甲氧羰基（Fmoc)磷酸酪氨酸合成的。由于在磷酸酪氨酸上缺乏一个侧链保护性基团（Kitas^d.，1994)，标准Fmoc合成和裂解步骤才得以应用（ChangandMeienhofer，1978);然而，要想达到氨基酸的有效偶联，在加入未保护的磷酸酪氨酸后，需要比标准步骤用量更高的超浓度的活化Fmoc氨基酸。在有些情况下，需要用双偶联法，即在加入磷酸酪氨酸之后再加入少量其他氨基酸以延长肽链。这种替代方法需要按合成肽的要求，有顺序地、反复加入下一个指定氨基酸。在本单元中阐述将肽偶联到亲和基质上的方法（见辅助方案2)，将肽段偶联到载体蛋白的常用方法将在单元13.1和单元13.3中阐述。

辅助方案2肽段偶联到Affi-Gd10亲和性基质

此方案描述了将磷酸肽和非磷酸肽偶联到Affi-Gel10亲和性基质上的方法，用于抗体的亲和柱层析纯化。这一步骤可生成3ml终末柱床体积的亲和性树脂，每毫升凝胶偶联3umol肽。

材料

用于偶联的合成寡肽（见辅助方案1)

二甲基亚砜（DMSO)

iV-甲基吗啉（99%纯度；AcrosOrganics)

Affi-Gd10(Bio-Rad)或类似活化支持基质

氨基乙醇

0.lmol/L氨基乙醇•HC1，pH8.0

高盐/髙pH溶液••0•5mol/LNaCl/0.4%(mAO碳酸氢钠

高盐/低pH溶液：0.5mol/LNaCl/100mmol/L乙酸钠，pH4.2

PBS/叠氮钠：含有0.02%(m/V)叠氮钠的PBS(附录1)

0.5mol/LNaCl

3mol/LNaSCN

聚丙烯螺旋盖离心管

直立圆筒（end-over-end)摇床

真空吸引器

玻璃层析柱，容量>5ml(Bio-Rad)，或带有1-cc硅化玻璃棉塞子的5ml塑料注射器

1.将合成寡肽按0.5〜4倍所需柱床体积的容量比溶解于DMSO。例如，9Mmol肽(15.3mg，对于一个平均15mer分子质量为1700的肽）对应3ml柱床体积。

2.按如下操作小心滴定以中和肽溶液：以1〜2ul增量加入肽合成级N-甲基对氧氮己环(高浓度或在DMSO中稀释到1:1〜1:9)，每次加入后移出2〜3ul等份，将其用50ul水稀释，然后点在pH试纸条上。重复这一步骤，直到pH达到7〜8(基本上每3umol肽需要7〜8ul，取决于氨基酸序列）

3.充分混匀Affi-Gd10亲和性基质瓶中的内容物，使树脂悬浮，然后将所需体积的树脂[2倍于柱体积（4倍于50%混悬物）的树脂]移至聚丙烯螺旋盖离心管，在DMSO中洗3次，每次在室温下以700g转速离心5min。吸出上清液，以5倍体积DMSO重悬树脂，然后再次以700g转速离心。不要超过推荐的转速进行离心，否则可能破坏树脂。

4.从树脂中吸出过量的DMSO,加入步骤2制备好的肽溶液，在室温下用直立圆筒振荡器孵育过夜。每毫升树脂加入纯氨基乙醇（消除未反应的酯基团），在室温下用直立圆筒摇床孵育2h，如步骤3在DMSO中洗2次。

5.如步骤3在pH8.0的0.lmol/L氨基乙醇•HCl中洗2次（第1次要在冰上进行，因为会产生大量热量），第2次洗涤后移出O.lmol/L氨基乙醇^HCl,更换新溶液，在4°C下用直立圆筒摇床孵育过夜，然后低速离心并吸出上清液。

6.利用步骤3中描述的方法，用高盐/高pH溶液洗3次、高盐/低pH溶液洗3次、PBS/叠氮钠洗3次，洗涤后的树脂保存于4°C，直至装于层析柱。

7.用O.5mol/LNaCl将基质混合为混悬物，然后灌入玻璃层析柱或带有1-cc硅化玻璃棉塞子的5ml塑料注射器底部，先后用10倍于柱体积的3md/LNaSCN和10倍于柱体积的PBS/叠氮钠洗涤每个层析柱。

辅助方案3磷酸酪氨酸偶联到Affi-Gd10亲和基质

此步骤可生成IOml终末柱床体积的亲和性树脂，每毫升Affi-Gd10偶联3umol磷酸酪氨酸。

材料

磷酸酪氨酸

0.4%(m/V)碳酸氢钠

lmol/LNaOH(可选）

氨基乙醇

0•lmol/L氨基乙醇•HC1，pH8.O

烧结玻璃漏斗和真空吸引器

玻璃层析柱，容量>14ml(Bio-Rad)

1.将磷酸酪氨酸按0.5〜4倍的预期柱床体积的容量比溶解于0.4%碳酸氢钠。例如，30umol磷酸酪氨酸（7.8mg，对于相对分子质量为261的磷酸酪氨酸）对应IOml柱床体积。如果简便些，可以多用些磷酸酪氨酸，因为它相对比较便宜。

2.用pH试纸条测定pH达到7〜8。如果有必要调整，可通过滴定来中和溶液，如加入少量lmd/LNaOH，每次加入后移出2〜3jlJ等份，然后点在pH试纸条上。重复这一步骤直到pH达到7〜8。

3.充分混匀Affi-Gel10亲和基质瓶中的内容物，使树脂悬浮，然后将所需体积的树脂[2倍于柱体积（4倍于50%混悬物）的树脂]移至连接真空抽吸器的玻璃陶瓷漏斗。洗3次，每次向树脂上灌入冷蒸馏水后进行抽吸，然后以同样方法用冰冷的0.4%碳酸氢钠洗涤最后一次。

4.用真空抽吸从凝胶中吸出大部分多余的液体，不必使其完全干燥，将其移至螺旋帽离心管，加入步骤2备好的磷酸酪氨酸溶液，树脂从瓶中移出（步骤3)到与磷酸酪氨酸溶液混合的时间间隔不要超过20min。在4°C下用直立圆筒摇床孵育过夜。

5.每毫升树脂加入2ul纯氨基乙醇（消除未反应的酯基团），在室温下用直立圆筒振荡器孵育2h。洗树脂2次，每次低速离心（见辅助方案2,步骤3)并吸出上清液，以5倍体积0.4%碳酸氢钠重悬树脂，然后再次低速离心。

6.如步骤4在pH8.0的0.lmol/L氨基乙醇•HCl中洗2次，第2次洗涤后移出0.lmol/L氨基乙醇.HCl，更换新溶液，在4°C下用直立圆筒摇床孵育过夜，然后低速离心并吸出上清液。洗涤、保存、填装树脂于层析柱中（见辅助方案2,步骤
7)。