| 实验方法原理 | 在PAP法的基础上重复第二抗体和PAP复合物，重复的连接抗体和PAP复合物可能有以下两种连接方式（图4-10）。第一种（A）重复连接抗体可与一个PAP中的抗HRP抗体上未饱和的Fc段结合，再与后加的PAP复合物相结合；第二种（B）重复连接抗体与特异性一抗分子上未饱和的Fc段相结合，第一抗体上结合了更多的桥抗体和PAP复合物。正是这两种连接方式，对抗原有了进一步放大作用，因而提高了PAP法的敏感性。但该方法也存在以下缺点：步骤多、费时、非特异性背景加重，因洗涤多而使脱片率提高。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 石蜡切片动物血清 试剂、试剂盒 | 蛋白酶特异性一抗桥抗体PAP复合物PBSDABH2O2BAB 仪器、耗材 | 滴管玻片 实验步骤 | 1.4μm石蜡切片58℃烤片4h，切片常规脱蜡至水。 2.蛋白酶消化或AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3.0.3％H2O2处理切片20min（室温），PBS洗3min×2次。 4.3％正常动物血清处理切片30min（室温），吸去多余血清，不洗。 5.适当稀释的特异性一抗孵育（4℃过夜或37℃60min），PBS洗3min×3次。 6.滴加桥抗体（二抗），37℃孵育40min，PBS洗3min×3次。 7.适当稀释的PAP复合物（要求与特异性一抗同一种属）37℃孵育40min。 8.PBS洗3min×3次。 9.重复步骤6～8。 10.常规BAB-H2O2显色。 11.水洗、复染、脱水、封片。 注意事项 | 1.假阴性及其处理 应用PAP法显示抗原含量较多的组织或冰冻切片抗原保存良好的标本时，可导致阴性结果。Bigbee（1977）的研究证实，阴性结果是由于第一抗体用董过高，与组织抗原结合过多，使相邻两个抗体的Fc段间的距离恰好是连接抗体的两个Fab段结合的长度，于是连接抗体不存在游离Fab段，仅存无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连接在与组织抗原结合的第一抗体上，导致阴性结果。尤其是冰冻切，而石蜡切片很少发生这种现象。克服的办法是将第一抗体尽量稀释。 2.桥抗体 也称连接抗体。它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力，因此，当第一抗体和PAP复合中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述二种抗体结合，起到桥的作用。为丁确保桥抗体的二个Fab段之一与第一抗体结合，另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体的浓度必须高于常规用的第二抗体。 3.PAP复合物 在PAP法和酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连接在一起。 其他 | |
