| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 用磷酸肽-BSA交联物免疫过的兔的粗制血清 试剂、试剂盒 | PBS／叠氮化物MgCl2 仪器、耗材 | 分光光度计透析袋填装有BSA-琼脂糖亲和介质的柱子填装有磷酸酪氨酸亲和介质的柱子填装有同种非磷酸肽亲和介质的柱子填装有同源的磷酸肽亲和介质的柱子填装有阳性-筛选的磷酸肽亲和介质的柱子 实验步骤 | 1.将填装有BSA-琼脂糖亲和介质的柱子和填装有磷酸酪氨酸亲和介质的柱子以串联的方式连接好。 2.使大约15ml的粗制血清通过重力作用流过两根柱子。用PBS／叠氮化物溶液洗涤直到所有的黄色血清穿过柱子（或用分光光度计检测流出液体的A280直至达到基底吸收值），再用5~10mlPBS／叠氮化物溶液洗涤，收集所有穿过柱子的洗涤液，其中可能含有所要的抗体。 待血清过柱后，可用以下步骤使柱子重生：依次用10倍柱床体积的3mol/LNaSCN和10倍柱床体积的PBS／叠氮化物溶液洗涤柱子，然后在PBS/叠氮化物溶液中储存于4℃待用。 3.使过柱后的血清通过重力作用反复多次流过填装有非磷酸肽亲和介质的柱子以尽可能地去除交叉反应，在每两次过柱之间依次用10倍柱床体积的3mol/LNaSCN和10倍柱床体积的PBS/叠氮化物溶液洗涤柱子以使柱子重生。 4.如果预期与同源磷酸蛋白质有交叉反应，用步骤3中的方法使上步过柱后的血清流过填装有同源磷酸肽亲和介质的柱子。 5.在收集阳性-筛选亲和纯化的馏分之前，预先浸润并洗涤长约25cm的透析袋。用透析夹夹住一端并检查是否漏液。同时预先准备6LPBS／叠氮化物透析液并冷却到4℃。 6.将上一步层析后过柱的血清流过阳性-筛选磷酸肽亲和柱3次，每次过柱后不要洗涤柱子。 7.收集最后一次流过柱子的血清，然后用5～20mlPBS／叠氮化物溶液（用量取决于预柱体积和柱床体积洗涤柱子，将洗涤液与过柱的血清合并。再用20mlPBS／叠氮化物溶液洗涤柱子，洗涤液分开收集以作为「洗涤」馏分。 8.选用下列离液剂进行洗脱：20ml3mol/LNaSCN,或依次用10ml3.5mol/LMgCl2和10ml4.5mol/LMgCl2。开始洗脱后，立即收集约3ml洗脱馏分直接到步骤5中准备的透析袋中，用透析袋夹夹住透析袋的近端并立即放入PBS／叠氮化物透析液。至少收集6次洗脱馏分。 9.将步骤8中收集的洗脱锻分于4℃对PBS／叠氮化物溶液进行透析。 10.通过测量280nm处的吸光值或蛋白质比色测量法测量并计算出透析馏分中蛋白质的产量。从15ml血清样品中通常可得到>1mg纯化抗体。 11.将抗体分装成小份并储存于-70℃；作为工作液的部分储存于4℃。 12.用ELISA和免疫印迹检测最终样品以及前面各步收集到的馏分的反应性和交叉反应性。 注意事项 | 其他 | |
