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【求助】自己制备的多克隆抗体做WB有三条带
2021-08-11
问题描述:

我用GST做融合蛋白免疫兔子制备了多克隆抗体,制备出的抗体通过了GST的柱子消除了与我的抗原有交叉反应的抗体,用鼠脑做WesternBlot有三条带,其中有我目的蛋白的条带,另外一条在26KDa-34KDa之间,还有一条大于130KDa,我目的蛋白是在55KDa-72KDa之间,我想问一下那两条杂带是什么?因为鼠脑中应该没有与我目的蛋白相似的蛋白了(用Blast做过蛋白比对,相似的蛋白并没有出现在WB中,在40KDa左右),那两个杂带会是什么呢?我能通过什么方法把它们去除呢?谢谢

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skykiller
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genius_at 制备出的抗体通过了GST的柱子消除了与我的抗原有交叉反应的抗体这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗?那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗,消除可能的交叉。另外,多抗的特异性抗体含量一般不超过20%,最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。
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mwliu
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如果你觉得纯化没问题,那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解,还有,如果你的抗体可以IP的话,可以试试做个IP后再来做WB,条带会比较单一。
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genius_at
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skykiller这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗?那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗,消除可能的交叉。另外,多抗的特异性抗体含量一般不超过20%,最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。谢谢!可能是我没说明白,不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白,这样既把GST交叉反应抗体给去掉,又把这个家族成员的抗体给去掉了。现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体,那些杂带没有结合,在过抗体的时候就给去掉了,但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了,是不是需要再过一下MillporeMontage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢?
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genius_at
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mwliu如果你觉得纯化没问题,那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解,还有,如果你的抗体可以IP的话,可以试试做个IP后再来做WB,条带会比较单一。谢谢!我觉得还是纯化的问题~~
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skykiller
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genius_at谢谢!可能是我没说明白,不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白,这样既把GST交叉反应抗体给去掉,又把这个家族成员的抗体给去掉了。这一步应该收集的是柱穿透样,是吧?genius_atwrote:现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体,那些杂带没有结合,在过抗体的时候就给去掉了,但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了有洗脱峰吗,纯化抗体浓度、纯化的规模有多大?用什么溶液洗脱的?genius_atwrote:是不是需要再过一下MillporeMontage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢?个人没有用过这个试剂盒。但如果是通用性的纯化抗体试剂盒,应该也就是ProteinA/G之类的方法。前面已经用抗原亲和柱纯化过了,再过这个柱没有意义。
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