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如何选择合适的二抗,五步法看这里
来自 : 达科为

PS:本文由蚂蚁淘撰写

免疫检测被认为是在基础研究、生物加工、诊断和临床应用领域中广泛使用的工具。尽管目的蛋白质的成功检测依赖于多个因素,但是抗体的质量被大家认为对检测效果影响最大的因素。由于免疫检测常常使用二抗结合一抗来协助检测、分选和纯化靶抗原,因此我们不仅需要一抗具有高特异性和高灵敏度,而且选择合适的二抗也是我们不得不考虑的至关重要的因素。

下面将逐步教您如何选择最适合实验的二抗:

第一步:应与一抗的来源物种匹配

首先确定您的一抗来源物种,记住一个原则:二抗的来源物种应该总是不同于一抗的来源物种。然后选择特异性识别一抗的二抗。例如当使用的是由兔子产生的多克隆一抗时,您则需要选择在另一种物种(例如小鼠、山羊或驴)中产生的抗兔二抗。大多数一抗是在常用的宿主物种如兔、小鼠、山羊或鸡中产生的。因此经常使用抗小鼠、抗兔、抗山羊抗鸡多克隆二抗进行检测。

第二步:根据实验目的,需选择合适的标记

我们应根据实验目的,来选择二抗合适的标记(如图1所示)。蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验,酶标记的二抗是最好的选择,如过氧化物酶或碱性磷酸酶;对于免疫荧光显微镜术或流式细胞术,使用荧光染料标记的二抗(FITC、DyLight、Cy染料等)更为典型;Rockland可提供多种荧光标记的二抗。而对于免疫沉淀实验,为了获得高质量的实验结果图,应选择与IP抗体无反应性的二抗。而RocklandTrueBlot®二抗完美的满足了这一要求(如图2所示)。△图1:根据实验目的,二抗应选择对应的标记

A

B

图2:传统二抗与TrueBlot二抗结果图对比

A:传统二抗非特异的结合了留在膜上的IP抗体重链和轻链,出现非特异条带;

B:TrueBlot®二抗仅只识别WB过程中的一抗,而不会与IP抗体的轻链和重链结合,从而消除了IP/WB实验中IP抗体变性后55kDa重链和23kDa轻链的干扰,降低背景,提高信噪比。

第三步:最好选择预吸附的抗体

预吸附(又称交叉吸附)的二抗可消除来自与其他物种、抗体片段、细胞或组织样品的免疫球蛋白的交叉反应性,从而改善抗体的特异性。二抗与来自另一物种的血清抗体蛋白交叉吸附,或者被几种物种的血清抗体蛋白的混合物吸附(即预吸附),这些高度交叉吸附的抗体显示出低水平的交叉反应,特别是在多重标记检测实验中尤其需要。Rockland提供多种预吸附二抗。(如图3所示)

△图3:Rockland提供多种标记的预吸附二抗,均被牛、鸡、山羊、兔、小鼠、大鼠、人等多种物种的血清抗体蛋白的混合物吸附,减少二抗的非特异性结合。

第四步:明确一抗的亚型

多克隆一抗通常是兔、山羊、驴或鸡γ链免疫球蛋白(IgG同种型),二抗应能够识别一抗的重链和轻链,因此应该选择一种抗IgG的二体。而单克隆一抗通常在小鼠、大鼠和亚美尼亚仓鼠中产生,此外还有兔子和人源性单克隆抗体。由于单克隆IgG抗体是亚类特异性的,因此使用针对该特定亚类的二抗是非常重要的。当您的一抗的亚类是未知的,您可以使用抗IgGF(ab)或考虑进行同种型检测。

第五步:有时候二抗越小越好

F(ab')2二抗是由胃蛋白酶消化完整IgG抗体获得,去除大部分Fc区域,同时使铰链区保持完整。得到的片段是MW~11kDa的二价。Fab二抗通过木瓜蛋白酶消化完整IgG抗体产生,以去除Fc区域而产生一种的~50kDa的单价抗体。F(ab')2和Fab抗体都消除了与细胞上Fc受体的非特异性结合,并由于其较小的尺寸而更有效地穿透组织。当使用具有Fc受体的组织或细胞(脾、外周血、造血细胞、白细胞、NK细胞等)时,选择F(ab')2和Fab以消除与Fc受体的非特异性结合。片段二抗是流式细胞术、免疫组织化学和免疫荧光的理想抗体。

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