酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
中文名
酶标记抗体
来源
方便
比活性
高
性质
稳定
标记方法
简易过碘酸钠法
获取抗体
可通过提取纯化而获得
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(HorserADIshPeroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP
DH2H2O2────→D2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
(1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2) 反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=────────÷───────=───×4
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶与蛋白质结合。
(1) 0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50μl与PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。
(5) 0.15MPH7.4PBS及生理盐水。
(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9) HRP(RZ
