ADAMTS(adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotif)aremultidomainextracellularproteinases,containingatleastonethrombospondintype-1repeat[1].Theenzymesareinvolvedinprocessingofextracellularmatrixproteinsandproteinsinthecirculation.ADAMTS5wasfirstpurifiedfrombovinenasalcartilageconditionedmediaandhumanADAMTS5CDNAwasclonedfromahumanlivercDNAlibrary[2].ADAMTS5consistsofaprodomain,acatalyticdomain,adisintegrindomain,athrombospondintype-1motif,aCys-richregionfollowedbyaspacersequenceandthrombospondinsubmotifs.Theprodomainismostlikelycleaved-offbyafurin-typeenzymebeforeADAMTS5isreleasedfromcells.
ADAMTS5isexpressedconstitutivelyinsynovium[3]anditdegradesaggrecan,themajorproteoglycanofarticularcartilage[4].LikeADAMTS4,anothermemberoftheADAMTS-family,ADAMTS5cleavesaggrecanat5sites[4].Fourcleavagesitesarelocatedinthechondroitinsulfate-richregionbetweenaggrecanglobulardomainsG2andG3,whileonesiteiscontainedintherod-shapedpolypeptidebetweenglobulardomainsG1andG2.Inaddition,ADAMTS5cleavesonemoresiteinthechondroitinsulfate-richregionthatisnotcleavedbyADAMTS4[4].ADAMTS5isinhibitedbyTIMP3[5,6]and2-macroglobulin[7].
Purity:AsjudgedfromSDS-PAGEtruncatedADAMTS5represents50%oftotalproteinofthepreparation.Theproteinconcentrationis0.1mg/ml.
SpecificActivity:AggrecanaseactivityoftheADAMTS5preparationisdeterminedwithrecombinantaggrecaninterglobulardomain(Aggrecan-IGDfromMDBiosciences).ADAMTS4hydrolyzesthe“aggrecanase”sitewithinthisdomain(peptidebondE373-A374inhumanaggrecan). Therecombinantsubstrateisincubatedataconcentrationof0.1μMwithADAMTS5in50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,5mMCaCl2,1μMleupeptin,1μMpepstatin,1mMPefabloc,0.05%Brij35for15minat37°C.AseriesofADAMTS5dilutionsrangingfrom103-to105-foldistested.Substratecleavageatthe“aggrecanase”-siteisestimatedfromtheappearanceofthehydrolysisfragmentwiththenovelN-terminusARGSVIL.Thefragmentisquantifiedwithtwomonoclonalantibodies,onedirectedagainsttheneoepitopeARGSVIL,theotheragainstthesequenceC-terminalfromtheneoepitope(InviLISAAggrecanaseActivityAssay).Underthespecifiedconditionsthehydrolysisrateis>0.5nmoleshydrolyzedsubstrate/minxmlADAMTS5preparationor>5nmoleshydrolyzedsubstrate/minxmg.
Inhibitors:ADAMTS5isinhibitedbytissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases3(TIMP3)andby2-macroglobulin(seesection3).EnzymeactivityisalsosuppressedbychelatorsofdivalentcationsasEDTAandbysyntheticmetalloproteinaseinhibitors.
StABIlity&Storage:RecombinantADAMTS5isstableuntiltheexpirydategivenonthelabelwhenstoredat-70°C.Theenzymecanbekeptat-20°Cforseveralweeks.Repeatedfreezingandthawingshouldbeavoided.
Applications:RecombinantADAMTS5isusedtostudythedegradationofextracellularmatrixproteoglycans,toscreenforinhibitorsofADAMTS5andtocharacteriseinhibitoractions.Theenzymepreparationcanalsobeutilizedinenzymaticandimmunochemicalassays.
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各位业内前辈,我们正在考虑引进符合GMP认证标准的CHO细胞系,用于表达可做疫苗生产的重组蛋白类。目前已有符合标准信息的是Thermofisher的CHO-S悬浮培养细胞资料,希望能再多了解一些和这株细胞类似的其他公司符合GMP标准的生产株细胞做个比较。谢谢指教!
开个贴,做好准备,已经有战友开始采用CTD格式写申报资料,大家多交流。
1. 金开瑞的与传统的蛋白表达系统相比,省略了耗时耗力的质粒转化、细胞培养、收集、破碎和离心等, 极大地提高了工作效率;
2. 反应体系小,能同时平行合成多种不同的蛋白质;
3. 反应周期短,能满足高通量配体筛选和蛋白质组学的科研要求;
4. 开放的反应体系,便于改变各项反应条件,有利于调控基因的转录,蛋白质的合成和翻译后修饰,避免包涵体的形成;
5. 稳定的反应体系,可以偶联其它工艺,形成自动化、程序化、规模化生产,加快重组蛋白的纯化、功能表征和后续的结构解析;
6. 无细胞结构限制,可用于生产对宿主有毒害作用的外源蛋白,避免蛋白表达对宿主细胞的致死作用;
7. 添加非天然氨基酸或同位素标记氨基酸,表达特殊蛋白。
8.对于多次跨膜或由于疏水性强导致的普通细胞系表达困难的项目有显著改善。
大家好,想请教大家一个关于HPLC方法学的问题。
目前我们做的一个蛋白药,没有标准品,液相建立一个方法只想用于纯度鉴定,不去定量,这个方法所得到的图谱就一个主蛋白峰,面积归一化法相当于100%,现在就这个方法的方法学验证提出下面几点疑问:
1.因为我只做纯度鉴定,这个方法的方法学应该做系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这些,还是按照定量的全套加上定量限、线性、范围、准确度这些?
2.纯度鉴定中,我觉得应该对杂质进行定量,但是我们的这个方法只有一个主蛋白峰,几乎没有杂质峰,这样的话这个方法学我应该以什么为标准证明纯度呢?需将样品进行适当的氧化、酸、碱破坏吗?然后证明破坏后主峰能和产生的杂质分开?
3.对应生物蛋白药的杂质,应该属于无法获得的,如果通过强破坏,这个杂质也是不好鉴定的,是不是我只需要知道主峰能和强破坏的降解物分开,就可以说方法建立成功?还是生物药没有必要做这个强破坏,简单的走一下系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这样的流程就行?
说的有点乱,主要是自己对这个生物药的HPLC纯度鉴定的方法学,实在是疑惑重重,希望有经验的大侠能帮忙解答下。非常感谢!
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