实验材料 | 待测蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 过硫酸铵4X凝胶上样缓冲液甲醇PdCl25X反应缓冲液TMPyP三氟乙酸Tris-二吡啶钌 仪器、耗材 | 加热器光交联反应器SepPakC18容器分光光度计注射器滤膜 实验步骤 | 一、用Pd(Ⅱ)金属化TMPyP1.将1mg(1.2umol)的TMPyP溶于1.4ml水中,然后加入0.34mg(1.9umol)的PdCl2,加热至95°C反应2h。
2.冷却样品,并用孔径为45um的注射过滤器过滤,加入TFA至终浓度为1%。 3.将溶液注入用1%TFA平衡好的SepPakC18容器中,用5ml1%的TFA冲洗容器。 4.用0.5ml的甲醇,将TMPyP-PcKII)洗脱到一预先称重的小离心管中。 5.甲醇蒸发后,将TMPyP-Pd(II)溶于1ml水中,在417nm处[e=158X103L/(mol·cm)]测出其浓度。 该试剂可在冷冻避光条件下无限期保存。 二、光交联蛋白质
1.在1.7ml的小离心管内准备总反应体积为20W的蛋白样品,其中含有蛋白质、1X反应缓冲液和125umol/L的TMPyP-Pd(II),避光反应。 2.在光裂解反应之前,加人5ul新鲜配制的过硫酸铵。确保样品管在样品支架上呈水平状态(即与光束平行)。 3.将SLP相机与光源间的挡板移开,控制快门的开启时间为0.5s,此处可以使用相机的自动计时器。在关上快门后,将相机与光源之间的挡板重新装上。 4.迅速加入7ul4X上样缓冲液,以终止反应。 5.SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝染色或Western印迹,对反应产物进行分析。 图10.26显示的是一个典型的交联反应实验结果。在这个实验中,用上述方法使UvsY发生交联反应。可以从第六列看到:只有在金属复合物和过硫酸铵均存在的情况下,闪烁曝光光裂解交联反应才得以发生。同时可以看到的是:在第三列上,在未加人过硫酸铵的情况下长期曝光,可发生氧分子介导的交联反应。 |
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