蛋白质复合体性质的研究一方案14 蛋白质阵列：用“三明治法”研究复合体溶液
| 实验材料 | 捕获抗体检测鸡尾酒混合液 试剂、试剂盒 | 裂解缓冲液磷酸盐缓冲液含40%甘油的PBS含0.01gmlBSA的PBS含500mmolL甘氨酸含0.1%Tween的PBS含1%BSA的PBST 仪器、耗材 | 偶联有蛋白G或蛋白A珠子的亲和层析柱设备BSA-NHS玻片离心机荧光片扫描仪孵育箱超声破碎仪 实验步骤 | 一、抗体阵列的制备要了解关于蛋白质阵列制备的详细介绍，可查阅本章介绍中的「10.8.2制作蛋白质阵列」部分。要了解梗概，参见方案11。 1.将捕获抗体溶于含40%甘油（体积分数）的PBS(pH7.5)中，使其终浓度达到0.5mg/ml。缓冲液中不能含有亲核性成分（如Tris)。 抗体常常会与BSA竞争性地与玻片发生连接反应。可用蛋白G或蛋白A的亲和层析柱将BSA除去。 2.为了使抗体连接到玻片上，将抗体阵列与玻片在室温条件下孵育2h。 3.在室温条件下，加人含500mmol/L甘氨酸的PBS(pH8.0)终止反应，作用时间为lh。 4.使用玻片之前，再用含O.Olg/mlBSA的PBS继续处理芯片30~60min，或者将玻片于4°C条件下浸泡在含0.Olg/mlBSA和0.2g/LNaN3的PBS中保存。 在这样的条件下，抗体阵列可保持1~2月的稳定。 二、抗体阵列5.哺乳动物细胞密度达到1O7个/ml后，在冰上加入裂解液。 6.超声破碎细胞后，4°C、15000~2000g离心lOmin，去掉不溶物。 7.用PBS将抗体包被的玻片（由第④步得到）冲洗两遍。 8.将细胞裂解液和玻片放人保湿器中，于室温共同孵育2~3h。 CoverWellPC200可以容纳200/ixl的细胞裂解液，而PC500可以容纳550沁裂解液。若阵列较小，可以只加人10~30ul裂解液，但要记得在玻片上用防水笔画上边界标记。 一般裂解液只需覆盖玻片就可以了。 9.依次用PBST、PBS冲洗玻片3次，每次lmin。 10.在玻片上加上鸡尾酒混合液，室温孵育lh。 11.依次用PBST、PBS冲洗玻片2次，每次lmin。 12.200g离心30s,以去掉残留的缓冲液。 13.用荧光片扫描仪观察芯片图像。 |
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发布于 ： 2018-08-07
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