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【求助】核表达的抗体,为何是这样的?
2015-11-14
问题描述:

这是本人最近在做的pax7的石蜡切片的免疫组化抗体来自abcom,修复方式为复合酶37摄氏度半小时,二抗10分钟(福州迈新sp法试剂套装推荐步骤),pax7是核表达的转录因子,是否应该在当个核中表达?而我的表达却是成片的,我做出来的效果如下图:


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Justin001
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这两张图上都没看到明显的核表达。试过热修复没有。我做过对照,核指标用EDTA修复液微波热修复,效果比枸橼酸和PBS好很多。酶消化的修复方式还是主要用于浆膜的指标
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天宝物华
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试试热修复。
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谢朗
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Justin001这两张图上都没看到明显的核表达。试过热修复没有。我做过对照,核指标用EDTA修复液微波热修复,效果比枸橼酸和PBS好很多。酶消化的修复方式还是主要用于浆膜的指标请问前辈你的EDTA微波热修复的具体操作过程是怎么样的?
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谢朗
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qq693056322试试热修复。前辈你好,这个指标我也试过枸橼酸高温高压修复,它表达的位置与上述图片中的差不多,但背景色更深,表达的特异性不够好,还有,这个复合酶修复后的片子好像苏木素复染的时候,不太上色,不知道这其中有什么门道?谢谢前辈的回复
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Justin001
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谢朗请问前辈你的EDTA微波热修复的具体操作过程是怎么样的?用EDTA修复液,配方网上有很多,查一下就可以了,嫌自己配麻烦市面上也有现成的卖,我做实验对照的时候查到武汉博士德公司有卖的。使用方式就跟PBS或枸橼酸的使用一样,浆组织浸没,微波炉高火至沸腾维持两三分钟,冷却几分钟之后再加热至沸腾(就是反复两次或多次),再冷却至室温
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wenshl2005
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不止是没有核阳性,感觉都是纤维着色哦~
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谢朗
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Justin001用EDTA修复液,配方网上有很多,查一下就可以了,嫌自己配麻烦市面上也有现成的卖,我做实验对照的时候查到武汉博士德公司有卖的。使用方式就跟PBS或枸橼酸的使用一样,浆组织浸没,微波炉高火至沸腾维持两三分钟,冷却几分钟之后再加热至沸腾(就是反复两次或多次),再冷却至室温EDTA修复液之前已经购买了,不过之前做的都是柠檬酸高温高压,微波修复没做过,查了一番资料,发现大家的做法也不太一样,所以具体操作也不知怎么样。另,是不是把温度维持在98度左右15分钟,就算达到热修复的要求了,那这样的话,用水浴法是不是来的更温和,可控性也更强?
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谢朗
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wenshl2005不止是没有核阳性,感觉都是纤维着色哦~有道理,因为有另一个抗体的表达有时候也与这有些相似,纤维着色的原因一般是为什么?感觉它的特异性还很好啊,哈哈。谢谢老师的关注与回复
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天宝物华
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水域微波均可,主要是控温。多试几个条件做好对照。
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wenshl2005
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谢朗有道理,因为有另一个抗体的表达有时候也与这有些相似,纤维着色的原因一般是为什么?感觉它的特异性还很好啊,哈哈。谢谢老师的关注与回复具体原因我也不清楚。酶修复我只做过一次,当时背景有点儿高,舍弃了。建议多用集中抗原修复方法试试(柠檬酸盐、EDTA等)刚刚瞟了一眼这个基因相关的文章,胚胎中的蛋白丰度应该还是挺高的。
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caatt
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这个是非特异性染色。染色都是在裂隙处,类似于边缘着色。
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谢朗
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wenshl2005具体原因我也不清楚。酶修复我只做过一次,当时背景有点儿高,舍弃了。建议多用集中抗原修复方法试试(柠檬酸盐、EDTA等)刚刚瞟了一眼这个基因相关的文章,胚胎中的蛋白丰度应该还是挺高的。第一次用了柠檬酸高温高压,一抗浓度梯度做,但出来的背景色都很强,也未见到特异性染色,所以改用了酶修复。谢谢老师提点,我再试试。
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谢朗
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cAATt这个是非特异性染色。染色都是在裂隙处,类似于边缘着色。嗯,确实可能是这样,我再用别的方法重复几次。
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谢朗
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qq693056322水域微波均可,主要是控温。多试几个条件做好对照。,结果出来,我再来回复
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谢朗
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试过热修复,EDTA/柠檬酸,还是未见特异性核表达,每次都做了对照和一抗浓度梯度,可能选择的抗体不太适合,时间来不及了,打算放弃这个指标了。谢谢各位老师前辈战友的热心回答