从石蜡包埋固定的组织中制备 RNA 实验
| 实验材料 | 石蜡包埋的组织样品 试剂、试剂盒 | 甲酰胺消化缓冲液乙醇肝糖异丙醇苯酚氯仿蛋白酶KTrizol二甲苯 仪器、耗材 | 微量离心管恒温箱 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 去离子化的甲酰胺 焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的水 消化缓冲液（lmol/L异硫氰酸胍,25mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%N-月桂酰肌氨酸，20mmol/LTris-HCl，pH7.5) 乙醇,100%和70% 肝糖 异丙醇 苯酚(pH4.3):氯仿（70%:30%) 蛋白酶K(60mg/ml，20U/mg) Trizol(Invitrogen) 二甲苯 2.特殊设备 微量离心管，2ml,无RNA酶 恒温箱，预调至37°C 水浴或恒温箱，预调至55°C 3.细胞和组织 石蜡包埋的组织样品，切割为5~50张5um厚的切片 二、方法 1.将组织块置于2.0ml微量离心管中，向样品中加1.8ml二甲苯。37°C温育20min。 2.稍微地离心样品，移弃上清液再加入二甲苯，重复温育和离心步骤。 3.用0.5ml乙酵洗涤组织。移弃乙醇，风干。 4.加80ul蛋白酶K(60mg/ml，20U/mg)和72ul消化缓冲液。55°C下振荡温育过夜。 5.再次加80ul蛋白酶K，55°C下振荡温育过夜。次日再次加80ul蛋白酶K,再次55°C下振荡温育过夜。 6.加等体积酚：氯仿，混合，在微量离心机中以最大转速离心5min。将液相转移到RNA酶的新管中。 7.加等体积异丙醇和2ug肝糖，-20°C放置30min。 8.在微董离心机中以最大转速离心30min。移弃上清液，用70%乙酵洗涤沉降物。 9.在微量离心机中以最大转速离心30min并移弃上清液。风干沉降物，将之再溶解20ulDEPC处理过的水中。加500ulTrizol。遵循Trizol方案（见本章方案3)，对一处做修改：在第一次Trizol处理后，将液相转移到无RNA酶的新管中，用500ulTrizol第二次处理样品。 10.向第二次Trizol处理过的液相加500ul异丙醇以沉淀RNA。 11.将RNA沉降物再溶解于20ul去离子甲酰胺中。-20°C储存RNA。 |
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发布于 ： 2019-04-06
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