质粒DNA的大量制备实验一氯化铯/溴化乙锭平衡离心法
| 实验方法原理 | 这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。 | ||||||||
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| 实验材料 | 裂解物 试剂、试剂盒 | TECsCl溴化乙锭乙醇 仪器、耗材 | 阳离子交换树脂离心管 实验步骤 | 1. 粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4mlTE缓冲液中，加人4.4gCsCl，溶解后，再加人0.4ml10mg/ml溴化乙锭。如果用的是上清（也就是来自于备选方案），按上清的体积依比例扩大CsCl和溴化乙锭。 2. 将溶液转人一个5ml的quick-seal快速封口的超离心管中，往管中加人1g/ml CsCl/TE溶液，封好离心管。 3. 于20°C，500000g离心3.5h或于20°C，以350000g离心14h以上。 4. 小心地取出管子，从管的顶端插入一支20-G针头，然后用带另一20-G针头的3ml注射器将质粒带吸出（针头插入质粒带下约1cm）。 5. 为了得到更高纯度的质粒DNA，在新管中进行第二次超速离心，管顶加有含0.1 mg/ml溴化乙锭的CsCl/TE缓冲液。 6. 按质粒DNA/EB溶液的1.5~2倍体积装DowerAG50W-X8柱子，用数倍体积的TE/0.2mol/LNaCl溶液清洗和平衡柱子。 7. 用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。立即收集流出液。 8. 用2倍于上样质粒溶液体积的0.2mol/LNaCl/TE溶液洗脱柱子两次，用同一管子收集流出液。 也可以用等体积TE饱和的正丁醇来除去溴化乙锭。充分涡旋振荡混匀，然后除去有机相，重复几次直至在紫外灯下看不见红色，然后加人3倍体积TE缓冲液来稀释氯化铯，在本方法中产生的含有溴化乙锭的有机废物应该妥善处理。 9. 加入2倍体积100%乙醇于室温或-20°C沉淀质粒DNA。于4°C，以10000g离心10min。沉淀DNA时温度不要低-20°C，以免氯化铯沉淀下来。 10. 沉淀用70%乙醇洗1遍，真空干燥，溶解于TE缓冲液，并于4°C保存。 注意事项 | |
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发布于 ： 2018-08-05
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