| 实验步骤 | 超速离心法提纯包装的HSV扩增子材料试剂 干冰 溶于含钙离子和镁离子的DPBS蔗糖溶液（30%V/V)，过滤除菌 仪器 Bioguard生物安全柜（BakerSteriguardII或同类产品） 离心管（锥形，15ml和50ml，无菌；Corning或同类产品） 医用台式离心机（IECGP8RCentra或同类产品） Cup超声仪（MisonixXL2010或同类产品） 镊子 冰箱：超低温（一80°C) 乳胶检查手套（无粉） 微型离心机（IECMicromax或同类产品） 微量离心管（0.5ml和I.7ml,无菌；Axygen或同类产品） 微型涡旋振荡器（VWR或同类产品） PA离心管（36ml容量，Sovall03141或同类产品） 移液器和无菌吸头（可调体积；RaininP-20、P-200和P-1000或同类产品) 超速离心机（SorvallDiscoveryIOOS或同类产品） 水平转子（Sorvall630/17Surespin或同类产品） 离心桶（预冷，Sorvall79338或同类产品） Q吸头（无菌） 一次性移液管（5ml、IOml和25ml容量，无菌） 水浴锅，（37±1)°C(VWR1235或同类产品） 方法 1•预冷超速离心桶（在冰箱里）和转子（在超速离心机里）。 2.用70%乙醇清洗36ml的超速离心管两次。用无菌的Q-tip清除所有剩余乙醇，倒置放在生物安全橱中空气干燥。 3.在37°C中水浴解冻以前得到的病毒（从方案4的步骤21中）。放置在冰上。 4.使用杯形超声仪（在冰上预冷）在第8个设置超声处理每个样品3次，开30s后关闭30s。 每次超声两个解冻的样品，经常加人新鲜的冰。 5.1290g离心病毒lOmin。 6.加人5〜7ml含钙离子和镁离子的冷DPBS到超速离心管。 7.再加人7〜IOml冷的、无菌的溶于DPBS的30%蔗糖到每个管中。 8.转移病毒上清（步骤5)到一干净的5ml锥形管，再次1290足离心lOmin。 9.第二次离心后，一滴一滴地加人澄清的病毒上清到蔗糖梯度超速离心管中。 10.加入充分的含钙离子/镁离子冷的DPBS到每管中直至离顶部〇•25cm。 11.使用70%乙醇除菌的镊子将管子放在预冷的桶趾。小心地换下并固定桶的盖子。 12.4°C在超速离心机中78OOOg梯度离心lh。 13.从每个超速离心管中倒出上清，用无菌的Q吸头清除残余的蔗糖。 14.在收取过程中，在每个T-150瓶里加入IOOfJ含钙离子和镁离子的PBS。置冰上不超过30min用来软化沉淀。 15.小心吹打使沉淀重新悬浮，并使沉淀团块打散。小心不要产生气泡。 16.转移悬液到1.7ml无菌的微量离心管中。瞬时离心（小于3s)，使所有不能悬浮的蛋白质碎片沉淀。 17•分装25〜IOOul病毒悬液到已标记、预冷的、无菌的〇.5ml微量离心管中。立即放在干冰上冰冻。放在标记的冰盒或冰袋中一80°C储存。 |
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